NAD 通过Sirt1/PGC1-α通路改善慢性脑低灌注模型线粒体损伤，减少ROS生成，从而改善认知功能，减轻神经炎症外文翻译资料

NAD 通过Sirt1/PGC1-alpha;通路改善慢性脑低灌注模型线粒体损伤，减少ROS生成，从而改善认知功能，减轻神经炎症

原文作者 Yao Zhao^1dagger;, Jiawei Zhang^1dagger;, Yaling Zheng¹, Yaxuan Zhang¹, Xiao Jie Zhang¹, Hongmei Wang¹, Yu Du1, Jian Guan²,

Xiuzhe Wang^1* and Jianliang Fu^1*

单位 1 上海交通大学附属第六人民医院神经内科，上海宜山路600号，中国，200233。2 上海市睡眠呼吸障碍重点实验室，上海交通大学附属第六人民医院，上海，中国。

摘要：背景：小胶质细胞介导的神经炎症在血管性痴呆中起重要作用，调节神经炎症已成为一种有希望的治疗靶点。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ）在多种神经退行性疾病模型中具有抗炎和抗氧化作用，但其在慢性脑低灌注（CCH）中的作用尚不清楚。方法：采用双侧颈总动脉结扎（BCCAO）建立SD大鼠CCH模型。每日腹腔注射NAD ，连续8周。对行为学检查、神经元死亡和神经炎症标志物进行分析。同时检测小胶质细胞线粒体损伤和活性氧（ROS）的产生。用RNA-seq方法研究其作用机制。在体外研究中，Sirt1在BV2小胶质细胞中过表达，以比较NAD 治疗对线粒体损伤和神经炎症的影响。结果：NAD 给药通过保护线粒体和减少ROS的产生，减轻CCH大鼠的认知功能障碍，抑制神经炎症反应。机制通路分析结果表明，CCH的不利作用可能与PPAR-gamma;共激活子1alpha;（PGC1alpha;）及其上游转录因子Sirt1基因表达降低有关，而NAD 处理明显逆转了它们的降低。体外实验证实NAD 对低氧诱导的神经炎症和线粒体损伤有保护作用，并可通过Sirt1/PGC-1alpha;通路保护小胶质细胞产生ROS。Sirt1过表达可模拟NAD 对BV2小胶质细胞的保护作用。结论：NAD 可改善体内外脑出血模型的认知功能障碍，减轻神经炎症反应，这些有益作用与激活Sirt1/pGC-1alpha;通路，保护线粒体和抑制ROS有关。

关键词：慢性脑低灌注； 小胶质细胞； NAD ； 线粒体； ROS

引言

血管性痴呆（VaD）是第二种最常见的痴呆形式^[1]，VaD的主要发病机制是慢性脑低灌注（CCH）^[2]。主要的病理变化包括神经炎症和氧化应激增加，线粒体功能和脂质代谢紊乱，生长因子表达下调^[3]。其中，神经炎症和线粒体损伤在CCH所致认知功能障碍的病因中起作用^[4]。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的主要炎症细胞^[5]。小胶质细胞持续监测大脑环境，并在各种信号的反应下被激活，包括内源性蛋白和外源性毒素^[6]。然而，在神经退行性疾病中，无调控的小胶质细胞的活化是导致神经元损伤的一个机制。越来越多的证据表明，在神经退行性疾病中，小胶质细胞的活化可导致神经元的损伤^[7]。研究发现，脑低灌注后小胶质细胞数量增加^[8-10]，激活的小胶质细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）-alpha;、白细胞介素（IL）-1beta;和IL-6等促炎因子，介导继发性脑损伤。这些促炎因子渗透到白质中，造成损伤和神经元丢失^[2]，最终导致学习和记忆功能障碍^[4,11]。靶向小胶质细胞被认为是治疗CCH所致认知功能障碍和脑损伤的一种有前途的策略。

线粒体是重要的细胞器，通过调节细胞代谢和活性的途径维持小胶质细胞完整和正常功能^[12]。然而，最近的研究表明，线粒体在协调先天免疫反应和获得性免疫反应方面起着至关重要的作用，从而将神经退行性疾病和神经炎症过程联系在一起^[13-15]。线粒体功能障碍和由此产生的活性氧（ROS）被认为在小胶质细胞初始和持续活化起关键作用^[16,17]。小胶质细胞中ROS的升高导致炎症和细胞死亡途径的激活^[18,19]。因此，靶向小胶质细胞ROS的治疗方法可能有助于减少神经炎症损伤^[20,21]。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ），也称为辅酶I，是调节中间代谢的关键信号分子^[22]。NAD 在氧化还原反应中起辅酶作用，也是参与维持线粒体内环境稳定的乙酰化酶（Sirts）的重要底物^[22]。补充NAD 可以改善线粒体功能，减少衰老和阿尔茨海默病（AD）模型中受损线粒体的积累和ROS的产生^[23-25]。此外，研究表明，NAD 前体烟酰胺核苷可以显著减轻AD小鼠模型的神经炎症^[26,27]。然而，NAD 是否能减轻CCH所致的神经炎症仍不清楚。本研究旨在探讨NAD 在CCH相关神经炎症损伤中的作用。

材料和方法

动物

雄性SD大鼠，体重160~180 g，6周龄，饲养在标准温度（20~25℃）、湿度（60%）、光照（12：12 h光/暗周期）的SPF屏障环境中。这些老鼠可以自由摄食和饮水。实验程序按照中国实验动物使用和护理立法的指导方针和《美国国立卫生研究院（NIH）实验动物护理和使用指南》中概述的原则进行。

慢性脑低灌注模型与给药

大鼠随机分为三组（n=15）：（1）假手术组（Sham），（2）双侧颈总动脉结扎（BCCAO）组（CCH），（3）双侧颈总动脉结扎（BCCAO） 八周250 mu;g/g/天 NAD （中国开封凯氏药业有限公司）（NAD ）^[25]。用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，采用BCCAO手术建立CCH模型。在颈部中部切开约1厘米，钝性分离皮下组织。然后仔细分离两侧颈总动脉和迷走神经，用4-0丝线双重结扎后从中间剪断。在缝合切口之前，伤口用青霉素治疗。假手术的动物接受了同样的手术，但没有结扎和剪断颈动脉。

激光散斑衬比成像

激光散斑衬比成像（LSCI）是一种基于散斑对比分析提供血管血流的指标的技术^[28,29]。采用直径0.8 mm的钻头从前囟所在的冠状缝到人字点所在的冠状缝对颅骨进行减薄和打磨。然后，用直径1 mm的钻头均匀打磨变薄的颅骨表面，直到硬脑膜上的血管清晰可见。打磨区域（5 mmtimes;5 mm）标记为感兴趣区。然后，老鼠被移到激光探头上，以监测脑血流。每只大鼠监测时间为5 min。用灌注散斑成像仪（Perimed，瑞典斯德哥尔摩）测量双侧颈总动脉闭塞前后脑血流量（CBF）的变化。

Morris水迷宫试验

术后第8周用Morris水迷宫（MWM）检测大鼠的空间学习记忆能力。MWM由一个高50 cm、直径180 cm、水深30 cm的圆形水池组成。MWM的水温维持在22plusmn;1℃，池子被均匀分成4个象限，在第二象限的中间放置一个直径为10 cm的圆形平台，平台淹没在水面以下2 cm处。泳池周围有充足的视觉线索作为参考对象。迷宫周围安装了窗帘，以遮挡远处的线索。然后将跟踪系统（View Point，美国）用于MWM。空间获取包括每天4次，共5天。在训练过程中，动物被放置在MWM所需象限中面向池壁的位置。老鼠被轻轻地放到水里（而不是掉进水里）。放开动物后，计算机自动启动跟踪程序。老鼠有1 min的时间搜索平台。如果大鼠到达平台，则允许其在平台上停留20 s，如果在1 min内未能找到平台，则将其引导至平台并停留20 s，每次测试记录到达平台的潜伏期为逃逸潜伏期。经过5天的训练，移走平台。在探索实验中，老鼠被放置在与平台位置相反的地方，面向池壁放入水中。让大鼠在水中自由游泳60 s，记录大鼠在象限停留的时间、穿越平台的次数和平均游泳速度。

免疫组化

MWM实验结束后，将大鼠大脑解剖成两个半脑，其中一个半脑连续石蜡包埋，切成5 mu;m厚的冠状面切片进行苏木精-伊红（HE）染色，另一个半脑用OCT包埋剂进行免疫荧光染色。对于HE染色分析，脑切片按照制造商的说明进行脱蜡、复水、苏木精-伊红染色。免疫荧光染色采用离子化钙结合适配器分子1（Iba1）抗体标记。简言之，切片用含3% 驴血清和0.3% Triton X-100的PBS封闭1 h，然后用Iba1一抗（1：500，Abcam）在4°C孵育过夜。然后冲洗切片，Iba1标记的切片用二抗（Alexa Fluor 594^reg;，1:500，CST）在室温下孵育1 h。最后，用PBS漂洗切片，然后用4′, 6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。染色在显微镜（IX53，Olympus，日本东京）下观察。对每只大鼠每隔100 mu;m在5个冠状切片上的神经细胞和Iba-1标记的小胶质细胞进行定量测定。

二氢乙锭染色

如前所述，ROS的测定采用二氢乙锭（DHE）染色^[30,31]。简言之，10 mu;m厚的冰冻脑片在37°C下，在避光的湿化室中用10 mmol/L DHE（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）孵育30 min。染色在显微镜下观察（IX53，Olympus，日本东京）。定量分析通过Image J软件（NIH，美国）从随机选择的五个区域计算平均得分。

透射电子显微镜（TEM）

海马组织用电子显微镜固定剂固定，4°C保存。然后用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）漂洗，用含1% OsO₄的0.1 M PBS（pH7.4）中室温固定2 h。然后将组织在乙醇中脱水，并将其包埋在树脂中。将树脂包埋组织放入65°C烘箱48 h，然后切割成60~80 nm的薄片，用聚醋酸甲基乙烯脂薄膜捞出到150目的铜网上。然后，用饱和醋酸铀乙醇溶液对铜网进行染色，并用透射电子显微镜（HT7800，Hitachi，日本东京）进行观察。

转录组测序分析

RNA-seq由OeBiotech（中国上海）进行分析。提取大鼠海马RNA（每组4只），构建cDNA库，进行RNA序列分析。以校正p值0.05和1的log2（倍数变化）作为显著差异表达基因（DEGs）的阈值。对各组DEGs进行GO和KEGG通路富集功能分析。

Western blot分析

在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich）中，冰冻裂解海马组织或培养的细胞。蛋白浓度由BCA试剂盒（Sigma-Aldrich）测定。蛋白质样品（30 mu;g/样品）经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到聚偏氟乙烯膜上。聚偏氟乙烯膜用5%脱脂牛奶封闭，用含一抗的TBS-T 4°C孵育过夜。本研究使用以下一抗：Sirt1（1:1000，Abcam）、PGC-1alpha;（1:1000，Abcam）和beta;-actin（1:5000，Abcam）。然后，TBST洗膜后，用相应的二抗室温下孵育1 h。免疫反应性用化学发光试剂（Thermo Science）检测，并用化学发光成像分析仪（Image Quant LAS 4000，美国佐治亚州）定量测定。图像分析采用Image J软件（NIH，美国）。

qRT-PCR

用EZ-EZ-press RNA纯化试剂盒（EZBioscience，美国）提取培养细胞或海马组织的总RNA。利用Reverse Transcription Master Mix（EZBioscience，美国）在45°C 15 min、92°C 15 s条件下逆转录总RNA。利用SYBR Green qPCR Master Mix（EZBioscience，美国）按照以下方案进行qRT-PCR：利用Strata Gene Mx3000p（Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉）进行变性（95°C，5 min）和40个扩增周期（95°C 10 s，60°C 30 s）。感兴趣的基因标准化为beta;-肌动蛋白，并将其折叠变化与对照样本进行比较。引物序列如表 1所示。

表 1 qRT-PCR引物

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