成分敲除融合UHPLC-HRMS代谢组学揭示姜黄中姜黄素类组分抗癌整合作用外文翻译资料

成分敲除融合UHPLC-HRMS代谢组学揭示姜黄中姜黄素类组分抗癌整合作用

摘要：

姜黄(姜科)根茎具有多种生物活性，其中包括显著的抗癌活性。姜黄作为一种中草药，其疗效表现为多组分，具有复杂的多靶点整合效应。因此，继先前从姜黄中发现了三种与A549细胞结合的姜黄素类化合物(姜黄素，Cur；去甲氧基姜黄素，DMcur；双去甲氧基姜黄素，BMcur)后，本文利用化学成分敲除和UHPLC-LTQ Orbitrap MS代谢组学方法，对这三种姜黄素类化合物的抗癌机制和整合作用进行了研究。通过成分敲除制备了四个含姜黄素的样品，包括含3个姜黄素的A549细胞结合成分群（CE）和3个单独的姜黄素类成分Cur、DMcur和BMcur（按姜黄中的天然比例的制备）。CE、Cur、DMcur和BMcur组分对A549细胞具有显著的抗癌活性。CE、Cur和BMCur组分的活性与姜黄粗提物(TcE)相当。在代谢组学研究中，CE和3个姜黄素组分改变了A549细胞中25种代谢物的表达，这些代谢物涉及甘油磷脂分解代谢、鞘脂代谢和脂肪酸代谢等，其中CE组甘油磷脂分解代谢严重紊乱，鞘磷脂代谢与DMcur和BMcur活性密切相关。代谢组学数据表明，3种姜黄素存在协同和拮抗作用，且多个姜黄素对A549细胞代谢的影响比单一姜黄素更强。

关键词：姜黄；姜黄素类化合物;抗癌整合作用；成分敲除；基于UHPLC-LTQ Orbitrap MS的代谢组学

缩写：UHPLC-HRMS，超高效液相色谱-高分辨质谱联用；Cur，姜黄素；DMcur，去甲氧基姜黄素；BMcur，双去甲氧基姜黄素；CE，含有3个A549细胞结合姜黄素的姜黄素提取物；TCE，姜黄粗提物；IS，内标；FBS，胎牛血清；ACN，乙腈；QC，质量控制；PLS-DA，偏最小二乘判别分析；OPLS-DA，正交偏最小二乘判别分析；VIP，投影中变量重要性；ROC，接收器工作特性；TIC，总离子色谱图；OSC，正交信号校正。

1. 简介

姜黄（姜黄科的根茎）是一种多年生块茎状的草本植物，具黄色花朵和宽阔的叶子，从古至今一直被用作调味品，染料，药物，化妆品，香料和食品的成分[1–3].例如，姜黄是一种重要的香料，也是咖喱的重要组成部分，在亚洲国家，姜黄使其呈黄色，而在西方国家，其芥末和调味酱[4]呈黄色.另外，姜黄粉还可用于为大米，海鲜，面食，肉类和蔬菜菜肴以及沙拉增添风味和色彩。此外，根据欧洲和中国药典，姜黄是欧洲和中国的官方药品，可用于治疗多种疾病，例如胸部和下软骨刺伤，胸部障碍和心脏疼痛，痛经和闭经等。[5,6].

姜黄在医疗上的重要性主要是因为它的多种生物活性来源于姜黄中的化学成分。姜黄的主要成分有姜黄素和精油两类次生代谢产物。其中，姜黄素(Cur)、去甲氧基姜黄素(DMCur)和双去甲氧基姜黄素(BMcur)被列为姜黄素类化合物的关键成分，精油中的主要成分是姜黄酮、beta;-姜黄酮和alpha;-姜黄酮[7-9]。已报道的姜黄化学成分或提取物的生物学特性包括利胆[10]、抗氧化剂[11]、抗炎[12]、抗菌[13]、抗病毒[14]、护肝[15]、保护心脏[16]和抗癌特性[17，18]。近年来，由于其在姜黄中的含量很高，特别是具有显著的抗癌作用，人们对其主要成分Cur进行了积累调查。研究证明，Cur对头颈部鳞状细胞癌[19]、胃[20]、结肠[21]、乳腺[22]、烟草诱导的肝癌[23]和肺癌细胞[24，25]均有良好或有效的抑制作用。

众所周知，中药的疗效表现为多组分，在多靶点上具有复杂的协同和/或拮抗作用的整合效应[26，27]。因此，我们推测，姜黄作为一种中草药，除了众所周知的Cur外，还可能含有多种抗癌成分。为了验证这一假设，我们建立了一种基于人肺腺癌细胞系(A549细胞)和UHPLC-LTQ Orbitrap MS的靶细胞提取-化学图谱方法，用于从姜黄中筛选抗肺癌活性化合物。最后筛选出3个与A549细胞结合的化合物，分别鉴定为BMcur、DMcur和Cur[28]。与Cur相比，BMcur和DMcur的研究要少得多，特别是它们在抗肺癌方面的潜在作用。

在我们前期工作的基础上，本文采用成分敲除技术，结合UHPLC-LTQ Orbitrap MS代谢组学技术，研究了三个结合A549细胞的姜黄素的抗A549细胞活性及其作用机制。利用我们在[29]之前开发的成分敲除方法，制备了姜黄素提取物(含有3个细胞结合姜黄素的混合物，简称CE)、BMcur、DMcur和Cur四个含有姜黄素的组分。用MTT法检测其对A549细胞和姜黄粗提物(Tce)的细胞毒活性，以确定其主要生物活性部位或化合物。这一策略顺应了中草药的整体思维，按照中草药中成分的自然比例制备和检测组分，与天然产物的药物化学完全不同，即先分离得到纯净的化合物，然后进行活性评价。同时，应用基于UHPLC-LTQ Orbitrap MS的非靶向代谢组学，通过对上述组分处理的细胞裂解进行分析，以了解这些组分或化合物在代谢途径上的作用机制以及协同和/或拮抗作用(见图3)。(S1)。据我们所知，3种姜黄素类化合物对A549细胞的抗肺癌作用按自然比例以及作用机制和整合作用对代谢谱的影响尚不清楚。

2.材料和方法

2.1.化学品，试剂和植物材料

姜黄素(Cur，gt;95%)、去甲氧基姜黄素(DMcur，gt;95%)和双去甲氧基姜黄素(BMcur，gt;98.5%)由中国北京国家食品药品检验所提供(见图)。(S2)。2-氯-L-苯丙氨酸，代谢组学内标，购自强生科学有限公司。(中国北京)人肺腺癌细胞系取自美国组织培养库。RPMI1640培养基和Gibco胎牛血清(FBS)来自马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Science。液质联用级乙腈(ACN)和甲酸来自默克公司(德国达姆施塔特)。去离子水18.20(MOmega;)由MILI-Q系统(德国默克市米利波尔)生产。其他涉及的试剂都是分析级的。

从中国不同地区收集了总共10批姜黄，并经浙江省食品药品检验研究院的郭增喜教授鉴定。

2.2.用成分敲除法制备姜黄粗提取物和不同馏分

将每批姜黄粉1克粉末混合以获得混合的姜黄粉。准确称取约0.2 g混合姜黄粉，然后加入25 mL纯甲醇放入锥形瓶中。然后将密封的锥形瓶通过超声波提取一个小时。离心后，将10mL上清液浓缩至干燥。将残余物溶解在0.5mL DMSO中，然后添加19.5mL的RPMI 1640培养基。充分摇匀后，使用容量瓶用RPMI 1640培养基将2 mL溶液补足至10 ml，以获得TcE。

CE、BMcur、DMcur和Cur组分是通过前面描述的成分敲除方法制备的[29]。简而言之，根据补充资料中描述的高效液相色谱分析条件，对20mu;L等量的TCE进行了分析。当洗脱开始时，A549细胞结合靶峰被收集在一个烧瓶中，其他的通过将6端口阀门切换到“加载”或“注射”位置而被收集在另一个烧瓶中(参见图)。(S1)。重复上述步骤，直到所有的收藏品都足以进行进一步研究。所有样品浓缩至干燥后，用相同体积的TCE试剂重新溶解，在HPLC上进样，以保持与敲除前相同的浓度，得到CE、BMcur、DMcur和Cur组分。

2.3.细胞培养和MTT细胞活力测定

在MTT分析之前，使用RPMI 1640培养基将TcE稀释2、4、6、10、20和50倍，以获得IC₅₀值和稀释倍数，以维持A549细胞的70％存活率来指导剂量TcE，CE，BMcur，DMcur和Cur组分用于细胞处理。

A549细胞在添加10U/mL青霉素、10mu;g/mL链霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培养基中维持。将融合的A549细胞接种于96孔板中，每孔2times;104个细胞。将细胞置于不同条件下(分别用上述各组分和不同浓度的TCE处理)48h后，取出培养液，用2 0micro;LMTT(5 mg/mL)在37˚C孵育4h，仔细抽吸液后，每孔加入15 0micro;L二甲基亚砜溶解形成的福尔马赞。用含有等量的姜黄组分二甲基亚砜的培养基处理细胞作为对照组。还设立了仅使用PBS的调零小组。每个处理浓度和每组包括6个重复。最后，用微型平板读取器在490 nm处测量每个孔的吸光度(Bio-Rad实验室，Hercules，美国)。细胞存活率(%)=(实验组OD-零调整组OD)/(对照组OD-零调整组OD)times;100%。

2.4.不同级分处理的A549细胞的代谢产物提取

将融合的A549细胞接种在6孔板中，并与TcE，CE，BMcur，DMcur和Cur组分孵育48小时，其中样品浓度与MTT分析中的浓度相同。使用用含有相同量DMSO的这些级分的培养基处理的细胞建立对照组。然后，通过以下步骤进行代谢物提取：1）完全吸出培养基，并用冷PBS冲洗两次；2）用胰蛋白酶消化并以1000 rpm离心5分钟，以在1.5 mL锥形管中收集细胞；3）将细胞沉淀置于干冰上30 s；4）加入1 mL冰冷的甲醇（含5mu;g/ mL IS，2-氯-L-苯丙氨酸）并涡旋1分钟；5）以13000rpm离心管10分钟以沉淀细胞碎片；6）将700 micro;L含代谢物的上清液转移至新的1.5 mL锥形管中，并用氮气干燥，并溶于70 micro;L 15％ACN水溶液中。在13000 rpm离心10分钟后，将上清液转移至自动进样瓶中，以进行UHPLC-LTQ Orbitrap MS分析。每组包括八个重复。为了使细胞代谢物的含量正常化，使用比辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（Beyotime Biotechnology Corporation，中国）对每组细胞的蛋白质浓度进行定量。

2.5.基于UHPLC-HRMS的代谢组学和统计分析

使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统（Thermo Scientific，美国加利福尼亚州圣何塞）分离样品，该系统配有在线脱气机，四元泵，自动进样器和热静态控制的柱温箱。使用配备电喷雾电离（ESI）源的Thermo LTQ Orbitrap Velos Pro质谱仪（Thermo Scientific）进行MS分析。分辨率设置为60000 FWHM，所有样品均在全扫描模式下运行。同时，数据依赖扫描用于提供MS / MS片段，用于鉴定代谢物。激活类型为碰撞诱导解离（CID），强度阈值设置为1000。动态排除设置为30秒，以排除重复MS / MS分析的前体离子。详细的LC条件和MS参数在补充数据表S1中进行了描述。

为了保证来自UHPLC-LTQ Orbitrap-MS系统的数据质量，将质量控制（QC）样品用于方法验证。通过合并每个细胞提取物的小等分试样来制备QC样品，以确保广泛的代谢产物覆盖范围。为了监控采集系统的重现性和稳定性，在整个UHPLC-LTQ Orbitrap-MS分析过程中，每五个样品都要分析一次QC样品。

为了获得每组的代谢特征，提出了如下的策略：1）通过SIEVE 2.1软件（Thermo Fischer Scientific）进行数据预处理；包括峰发现和重排，基线校正和峰过滤；2）用IS和细胞蛋白浓度对每个峰强度进行归一化；3）生成三维数据矩阵，该矩阵由样品信息，带注释的峰指数（峰保留时间（RT）和质荷比（m / z））和归一化峰强度组成；4）多元统计分析，将生成的三维矩阵导入SIMCA-P 14.1软件（Umetrics AB，Umearing;，瑞典）以执行主成分分析（PCA），偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。

2.6.差异代谢物表征和代谢途径分析

应用监督多元统计模型OPLS-D

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