在石斛系统发育分析中金钗石斛SSR标记的转移性研究表达序列标签（ESTs）及其利用外文翻译资料

在石斛系统发育分析中金钗石斛SSR标记的转移性研究表达序列标签（ESTs）及其利用

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2013年2月20日收到

以修订形式收到2013年4月3日接受2013年4月7日接受

关键词：石斛 表达序列标签（EST） 简单序列重复标记（SSR）可转染性 发展史

摘要：

金钗石斛遗传标记资源的有限性。 阻碍了该物种的遗传研究，以改善其园艺和农业性状。 与其他方法相比，EST数据集的微卫星标记的生物信息学挖掘是最有效和经济的方法之一。 我们的研究旨在生成新的EST-SSR标记，并评估它们在石斛属的系统发育研究中的跨物种利用的潜力。 通过对正常化的cDNA文库进行测序来组装总共1835个unigene EST，其中鉴定了500个SSR基因座。 在这些SSR中，38.0％（190）是二核苷酸重复，其次是三聚体（189,37.8％），六聚体（81,16.2％），五聚体（19.3.8％）和四聚体（21,4.2％）（AG）n和（AAG）n分别在二聚体和三聚体中占优势。 开发了一百七十个新颖的D.nobile EST-SSR标记，其中142个已成功转移至其他31个石斛属物种中的至少一个中，该属的平均可转移性为42％。 选择具有高跨物种转移性和高遗传多样性的SSR标记进行系统发育分析，结果显示不同部分之间存在复杂的遗传结构以及在石斛属植物部分内具有广泛的遗传分化。 这些微卫星标记丰富了当前分子标记资源，有助于进一步进化和遗传多样性研究，种质鉴定，遗传作图，以及金钗石斛和其他同属物种的分子育种。

1. 介绍

石斛兰是兰科（Lanchidaceae）三大属中的一个，它属于世界范围内的1500多种（Baker and Baker, 1996). 在中国有七十四种石斛属植物，主要分布在岭南的南部地区（Tsi 等人， 1999). 石斛属物种广泛用作园艺，农业，药用或双重目的物种，其中不同的艳丽花卉使其成为最广泛的观赏兰花之一(Tsi et al., 1999).具有清除人体组织中积累的有毒物质，提高人体免疫力，降低血糖水平，延长寿命等特殊疗效，使一些中药在几个世纪中得到了应用(Bulpitt et al., 2007; Zheng et al., 2010). 例如，石斛（Dendrobium nobile Lindl。），基本药用树木物种之一，以及石斛菊花墙（Dendrobium chrysanthum Wall）。 ex Lindl，石斛兰（Dendrobium mbriatum Hook。），石斛兰（Dendrobium loddigesii Rolfe）和石斛兰（Dendrobium ofcinale Kimura＆Migo），被列入中国药典(Chinese Pharmacopoeia Commission, 2010).

长期以来，这些石斛属植物的利用主要依靠野生资源的大量采集，但自我繁殖能力不足和广泛的需求导致野生种质资源受到过度开采的压力，现在许多石斛物种在中国被列为受保护和保护的濒危物种。 另一方面，目前石斛的育种计划在一定程度上相对比较成熟，但对其药用方面的关注最少，因此一些物种现在正在体外繁殖或未育。 因此，迫切需要保存野生种质资源。 物种特征描述是保护计划的主要步骤。 传统上，评估石斛属的系统学的一般方法取决于形态(Carlsward et al., 1997; Dressler, 1993)和解剖分析(Morris et al., 1996; Stern et al., 1994). 但是，这些特征往往受植物变异性和生长环境的影响。

表1

本研究中使用的石斛种。

杭州师范大学浙江省药用植物遗传改良与质量控制重点实验室（中国杭州）移植了所有物种。

补充表1使用材料代码。

用于“铁皮凤斗”加工的两种类型，Y =英交，R =软交;

从该物种中探索了补充表1中所示的通过测序验证的170个EST-SSR。

现在，分子标记如RFLP（限制性片段长度多态性），RAPD（随机扩增多态性DNA），ISSR（简单序列重复序列）和AFLP（扩增片段长度多态性）标记已经成为现代植物分类学家的重要工具工作台 （卡莉达 等人， 2009; 刘 等人， 2001; 王 等人， 2009; 岳 等人， 2006). 称为简单序列重复序列（SSR）的微卫星是1-6bp串联重复的DNA基序，其在给定基因座处的重复数目可能不同Tautz， 1989). 与其他DNA标记对PCR扩增条件敏感或对相对复杂的操作密集程度不同，SSR标记是多等位基因，共显性遗传，相对丰富，广泛分布于整个基因组中，并且易于甚至自动评分（鲍威尔 等人， 1996), 并已用于基因鉴定和亲子鉴定（Buteler 等人， 2002; Malysheva作 等人， 2003), 遗传多样性分析和系统发育研究（卓 等人， 2000; 戈尔茨坦 和 克拉克， 1995; Pupko 和 Graur， 1999; 朱 等人， 2000), 遗传图谱的构建（Temnykh 等人， 2000), 等等。 在铁皮石斛属中，SSR标记已被报道仅用于D.chinale和D.mbriatum（顾 等人， 2007; 鲁 等人， 2012A，B; Xie 等人， 2010). 尽管如此，目前还没有关于金钗石斛SSR标记开发的信息，这阻碍了这种濒临灭绝的经济上重要的中药材的遗传研究。

为了开发这种非模式植物丰富的新EST-SSR标记，构建了一个D.nobile的全长cDNA文库，以提供大量的高质量EST。 同时，测试了这些EST-SSR位点在大量相关石斛属物种间的交叉分类可转移性。 此外，微卫星重复基序通过验证测序石斛属物种中的物种特异性PCR带。 最后，选择具有高跨物种转移能力和基因多样性的EST-SSR标记来评估31种中国石斛种的系统发育。 本研究中新开发的EST-SSR标记可以丰富目前的分子标记资源，并有利于金钗石斛和其他同属物种的遗传研究和分子育种。

2. 材料和方法

2.1. 植物材料

中国云南，贵州，广西，广东和浙江省共收集到31种石斛品种，并在杭州师范大学温室种植。 使用中国科学院植物研究所植物标本馆保存的凭证样本对所有物种的鉴定进行验证和鉴定（http://www.nhpe.org）。 包括广泛用于加工医药草药“铁皮枫斗”的两种类型（硬脚和软脚）（补充图1）。 目前收集的物种包括来自Stachyobium和Stuposa部分的一个代表性物种，Breviores和Formosae部分的两个物种，以及来自克氏锥虫科的三个物种，以及来自石斛属植物部分的其他物种表格1）。

与本文相关的补充数据可以在网上找到http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta。 2013.04.011.

2.2. 基因组DNA提取

使用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法从新鲜叶组织中提取基因组DNA(Rogers and Bendich, 1985), 并通过NanoDrop 1000（Thermo Fisher Scientic，Wilmington，DE，USA）测定每个DNA样品的浓度。

2.3. RNA提取和cDNA文库构建

使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Tokyo，Japan）从D.nobile提取总RNA。 第一和双链cDNA用SMART cDNA文库构建试剂盒（Clontech，USA）合成。 用蛋白酶K灭活DNA聚合酶活性并纯化后，用SI消化双链cDNA以产生粘性末端，使用Column Spin H-400收集cDNA大小部分。 将大小为1.5-3kb的cDNA片段连接到lambda;TriplEx2载体（Clontech，USA）中，并进行体外lambda;噬菌体包装连接以产生未扩增的cDNA文库。 在通过使用LB /四环素制备的从XL1-Blue平板拾取的过夜培养菌落对未扩增文库进行滴定后，转化并扩增文库。 最后，挑取阳性克隆并使用ABI 3730遗传分析仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）从3和5两端进行双重测序。

2.4. EST序列聚类和组装

通过对数据库UniVec (ftp://ftp. ncbi.nih.gov/pub/UniVec/)的搜索，检测出了超过150个bp的序列。EST微调pl脚本(http://pgrc. ipk-gatersleben.de/misa/download/est trimmer.pl)被用来消除聚/ T尾巴和N个字符;通过Phrap(http://pgrc. ipk-gatersleben.de/misa/download/est trimmer.pl)获得了最一致的序列。

2.5. EST功能注释和分类

通过BLAST针对NCBI（国家生物技术信息中心）核苷酸（Nt）和非冗余蛋白（Nr）数据库以及Uniprot / SwissProt和KEGG的蛋白质数据库（京都基因和基因组百科全书），BLAST对包括重叠群和单倍体的独立基因进行功能注释），其中e值le;1e-5的意义阈值。 使用GETORF（EMBOSS）预测开放阅读框（ORF）。 最后，通过EST序列编码的蛋白质经历COG（蛋白质的直系同源组群），Interpro和GO（基因本体论），以1e-10的e值截止值进行比对和分类。

2.6. EST-SSR分离，引物设计和标记物验证

基于Perl的脚本MIcroSAtelitte（MISA，HTTP：//pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/）用于筛选微卫星的存在，设置为检测至少5个完全重复核心基序的2-6个核苷酸的串联重复序列。 化合物SSR被定义为ge;2个SSR中断le;50个碱基。 将具有适当序列的EST序列提交至引物3.0（Rozen and Skaletsky, 2000)用于引物设计，引物长度为20plusmn;2个核苷酸，GC含量为40-60％，最适退火温度至少为50C，PCR产物大小为100至300bp。

引物用于扩增金钗小麦基因组DNA中的SSR位点，对带有清晰和预期大小的条带的扩增条带进行测序以验证相应的重复基序。 所有的D.nobile SSR序列与石斛兰进行比较先前报告的SSR(Bulpitt et al., 2007; Lu et al., 2012a,b; Rozen and Skaletsky, 2000).在含有50-100ng基因组DNA，1单位Taq聚合酶和1times;PCR通用缓冲液，1.5mu;MMgCl 2，200mu;M每种dNTP（TaKaRa，Kyoto，Japan）的20mu;L反应混合物中进行PCR，并且将0.2mu;M的每种引物。 PCR扩增在GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）中用程序95C进行5分钟，随后进行30个循环95℃℃1分钟，每个引物对的退火温度1分钟（表格1）， 和在72C下2分钟; 和在72C下5分钟的最后一步。 使用Sequi-Gen GT测序细胞（Bio-Rad，Hercules，California，USA）将PCR产物在6％（w / v）聚丙烯酰胺变性测序凝胶（7M尿素）上解析。 使用银染色显示SSR图谱，并且通过10bp DNA梯（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）评估SSR片段大小。

2.7. D.nobile EST-SSR标记的跨物种扩增

每个D.nobile EST-SSR标记的跨物种可转移性在其他30个远缘相关的石斛属物种中被探索，如表格1。 从非变性聚丙烯酰胺凝胶中切下具有所需条带的PCR片段，使用EZ-10 Spin Column DNA凝胶提取试剂盒（Biobasic Inc.）纯化并连接到pUC18载体（TaKaRa，Japan）中。 选择每个物种的三个阳性克隆进行测序。 然后使用ClusterW方法在软件MEGA V5.0 (Tamura et al., 2011). 手动关闭多个空位以对重复序列进行分组。

2.8. 遗传多样性和系统发育分析

对于每种石斛属物种的多样性分析，将用EST-SSR标记物扩增的片段评分为存在（1）或不存在（0）。 使用Power Marker版本估计每个微卫星基因座处的等位基因数目，观察到的基因型数目，基因多样性和多态信息含量（PIC）3.25 (Liu and Muse, 2005). 在软件Power Marker下基于等位基因共享距离构建邻接树，使用MEGA查看和编辑树状图树。

3. 结果

3.1. D.nobile中非冗余EST-SSR的频率和分布

从cDNA文库中随机挑选4800个菌落进行双向测序，产生3024个高质量读数（ge;100bp）。 序列数据分析组装了1835个unigenes（603个重叠群和1232个单倍体），平均长度为0.8kb，其代表约1470kb推定的功能性银行转录物。 总共400个unigenes包含500个非冗余SSR位点（表2），平均SSR分离约为2.94kb。 其中，400个（18.25％）序列中的73个包含多于一个SSR基因座。

在所有检测到的候选SSR基因座中，二核苷酸重复是最丰富的（190，38.0％），其次是三 - （189，37.8％），（81，16.2％），五 - （19，3.8％）和四 - （21,4.2％）。 （CG）n和（CCG）n的同时，（AG）n和（AA

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