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通过液相色谱-质谱分析中的优化样品提取策略改善对多种环境抗生素的检测

Xinzhu Yi amp; Steacute;phane Bayen amp; Barry C. Kellyamp; Xu Liamp; Zhi Zhou

摘要 本次研究运用固相萃取/液相色谱/电喷雾电离/多级质谱（SPE-LC-ESI-MS/MS）等检测方法对城市地表水和土壤中多种抗生素的灵敏度的同时检测进行了优化。在优化的样品提取pH值下，在七类测试抗生素中，大环内酯类，林可酰胺，氯霉素和聚醚类抗生素的提取效率得到了显著提高。结果表明，不仅在酸性条件下更有效地提取了pKa值低（lt;7）的抗生素，而且在中性条件下更有效地提取了pka值高（gt; 7）的抗生素。 pH对极性化合物的影响比对非极性化合物的影响更为明显。提取pH值的优化可显著改善样品回收率并提高检测限。与文献中报道的值相比，本次研究中获得的最小检出限在地表水中平均降低87.6%，在土壤中平均降低67.1%。此方法随后用于检测人口稠密的城市环境样品中的抗生素以及大环内酯类，磺酰胺和林可霉素被频繁发现。检测到的最高浓度的抗生素是地表水中的磺胺二甲嘧啶（82.5 ng / L）和土壤中的红霉素（6.6 ng / g干重）。优化的样品提取策略可用于改善环境地表水和土壤中各种抗生素的检测。

关键词：液相色谱-质谱 pKa 抗生素 提取效率 地表水 城市土壤

Abstract A solid-phase extraction/liquid chromatography/electrospray ionization/multi-stage mass spectrometry (SPELC-ESI-MS/MS) method was optimized in this study for sensitive and simultaneous detection of multiple antibiotics in urban surface waters and soils. Among the seven classes of tested antibiotics, extraction efficiencies of macrolides, lincosamide, chloramphenicol, and polyether antibiotics were significantly improved under optimized sample extraction pH. Instead of only using acidic extraction in many existing studies, the results indicated that antibiotics with low pKa values (lt;7) were extracted more efficiently under acidic conditions and antibiotics with high pKa values (gt;7) were extracted more efficiently under neutral conditions. The effects of pH were more obvious on polar compounds than those on non-polar compounds. Optimization of extraction pH resulted in significantly improved sample recovery and better detection limits. Compared with reported values in the literature, the average reduction of minimal detection limits obtained in this study was 87.6 % in surface waters (0.06–2.28 ng/L) and 67.1 % in soils (0.01–18.16ng/gdrywt). This method was subsequently applied to detect antibiotics in environmental samples in a heavily populated urban city, and macrolides, sulfonamides, and lincomycin were frequently detected. Antibiotics with highest detected concentrations were sulfamethazine (82.5 ng/L) in surface waters and erythromycin (6.6 ng/g dry wt) in soils. The optimized sample extraction strategy can be used to improve the detection of a variety of antibiotics in environmental surface waters and soils.

Keywords : Liquid chromatography-mass spectrometry ；pKa ；Antibiotics ；Extraction efficiency；Surface waters ; Urban soils.

研究介绍

痕量低磷环境抗生素已在城市地表水^[1]和生物固体改良土壤^[2]中广泛出现，近年来引起了公众的极大关注。环境抗生素可能对水生生物造成不良健康影响，或对促进耐药性细菌的生长产生选择性压力，从而间接影响人类健康， 因此，为进行全面的环境风险评估应该准确定量环境抗生素。 然而，由于抗生素浓度低和环境基质的复杂性，在环境样品中对抗生素进行准确定量通常很难。常用的液相色谱-质谱法标准方法1694是由美国环境保护署（US EPA）开发的，用于分析药物和个人护理产品^[3]，并已用于分析水和土壤中的环境抗生素^[4，5]。由于该方法在具有不同化学特性的环境抗生素的样品提取中存在局限性，因此尚未用于针对多种环境抗生素的有效和灵敏检测的全面优化，并且先前的研究表明，液相色谱/质谱（LC / MS）分析的样品提取准确性可能 受一些因素的影响，例如基质效应，溶剂，pH，萃取技术和药筒。

EPA方法1694已主要用于水样分析，但尚未充分研究样品提取的效果以及土壤样品的适当内标和相关基质的影响。 先前对抗生素的研究主要集中在农业土壤，堆肥土壤，再生水灌溉土壤和施肥土壤上，但对城市土壤中抗生素的研究却很少。 在土壤环境中经常检测到的抗生素包括四环素，磺胺类，喹诺酮类，大环内酯类，林可霉素，氯霉素和离子载体^[6-8]，但这些抗生素通常没有用一种方法进行分析。 因此，重要的是开发一种灵敏的LC / MS方法，以同时检测环境土壤中的多种抗生素并评估基质效应。

萃取溶剂也可能影响萃取效率。在先前的研究中，酸性缓冲液和有机溶剂的组合已用于从固体基质中提取抗生素。甲醇，乙腈和乙酸乙酯是三种常用的有机溶剂，而磷酸盐缓冲液和McIlvaine缓冲液是从固体基质中提取抗生素的两种常用酸性缓冲液^[9，10]。通过在乙腈和磷酸盐缓冲液中加入乙二胺四乙酸（EDTA）从而得出，在四环素，磺酰胺，喹诺酮和罗红霉素的萃取中获得了比在甲醇和McIlvaine缓冲液中加入EDTA更好的萃取性能^[11]。此外，Ho等。结果表明，在USEPA方法1694中使用的乙腈和磷酸盐缓冲液，对低极性化合物的回收率更高，而甲醇和McIlvaine缓冲液在提取高极性分析物方面表现更好^[12]。由于腐殖酸和黄腐酸在乙酸乙酯中的溶解度低，从而降低了基质效应，所以使用乙酸乙酯萃取四环素[13]，大环内酯类和离子载体[14]，但乙酸乙酯可能会降低分析物的回收率。因此，需要确定适当的同位素标记的内标，以评估萃取溶剂的样品回收率。

提取pH是另一个可能影响抗生素提取效率的重要因素^[15]。先前已将广泛的pH值范围用于提取抗生素。 Vanderford等在pH 2.0下同时萃取红霉素-H2O和磺胺甲基异恶唑，并在pH 13下提取其他药物^[16]。 pH为3.0的溶液用于提取红霉素，罗霉素，泰乐菌素和7种磺胺类药物^[17]。 pH 4.0用于提取阿贝霉素，红霉素，克拉霉素，罗红霉素和五种磺胺类药物（Gouml;bel等人）^[18]。也有研究使用两个pH值分别提取磺酰胺和大环内酯。例如，Miao和Spongberg使用pH 3.0提取四环素和磺酰胺，使用pH 6.0提取大环内酯^[19，20]。但是，在EPA方法1694中仅使用酸性条件进行样品提取，除了少数几种在碱性条件下提取的化合物。因此，迫切需要定量评估萃取pH对样品萃取效率的影响。

另外，三种萃取技术通常用于从土壤样品中萃取抗生素：（1）超声波辅助萃取（UAE），它通过超声作用分解固体物质并协助有机溶剂萃取有机化合物^[21]； （2）微波辅助萃取（MAE），利用微波能量将溶剂和固体样品加热混合，以促进分析物从样品基质分配到溶剂中^[22]； （3）加压液体萃取（PLE），可保持升高的温度和压力，以增强分析物的传质和溶解度^[23]。由于高度的自动化，MAE和PLE更易于操作，但价格昂贵。相反，超声波辅助萃取提供了一种简单的提取程序，但需要相对较长的分析时间。在萃取性能方面，一项先前的研究表明，这三种方法所需的溶剂量相似，并且具有相似的灵敏度，选择性，准确性和精密度^[24]。因此，提取技术的选择可以由成本因素而不是分析因素决定^[21]。超声波在城市环境样品中多种抗生素的优化检测中的应用仍然受到限制。

提取用的容器也会影响提取效率。尽管在线SPE / LC / MS / MS，TurboFlowtrade;色谱/ LC / MS / MS和快速分离LC / MS / MS的发展迅速，由于萃取设备易于获取且成本相对较低，所以常规固相萃取（SPE）方法仍然是最常用的技术，因此可用于LC / MS分析。人们已经开始使用不同类型的SPE柱（包括C18，碳，聚合物吸附剂（ENV，ENV ，EN，PPL，亲水/亲脂平衡（HLB）），弱阳离子交换剂（CBA）和混合相阳离子交换柱）来提取抗生素，而HLB SPE柱仍是样品提取的最佳选择^[25–27]。大多数研究已使用Waters Oasis HLB滤芯从环境水基质中提取磺酰胺，大环内酯，林可酰胺和beta;-内酰胺^[28]。 Strata X和Oasis MCX已用于提取磺酰胺，大环内酯类，林可酰胺和beta;-内酰胺^[28-30]。环境水中的莫能菌素和氯霉素用Oasis HLBSPE墨盒^[31-36]或StrataX ^[37]提取。通过使用Isolut ENV SPE柱从水样中提取呋喃唑酮，但回收率仅为36％^[38]。 Supeltrade;Select HLB SPE包含具有亲水改性的疏水成分，可用于保留各种极性和非极性抗生素，并且据报道这可用于分析环境水样品中的抗生素。

这项研究的目的是通过优化的固相萃取/液相色谱/电喷雾电离/多级质谱分析（SPE / LC / ESI / MS / MS）从而优化样品提取策略，以用于改善多环境抗生素的检测。该优化方法随后被用于测量人口稠密的城市城市中不暴露于处理过的废水地表水和土壤中抗生素的存在和浓度。研究共对7类13种抗生素进行了分析，其中包括4种大环内酯类抗生素（阿奇霉素，克拉霉素，红霉素，泰乐菌素），一种林可酰胺抗生素（林可霉素），一种氯霉素抗生素（氯霉素），一种聚醚抗生素（莫能菌素），硫磺酰胺抗生素（磺胺嘧啶） ，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲恶唑），两种beta;-内酰胺抗生素（阿莫西林，头孢噻呋）和一种硝基呋喃抗生素（呋喃唑酮）。这些化合物是根据其广泛的用途，医学意义和各种化学特性选择的。评估了提取效率和各种影响因素。改进的环境抗生素检测方法应为环境抗生素的综合环境风险评估提供有用的信息。

材料与研究方法

化学成分与材料

被测抗生素的化学结构和特性列于表S1的电子补充材料（ESM）中。 抗生素和Supeltrade;Select HLB SPE药筒（60 mg，3 mL）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。 阿莫西林·3H2O（苯基-13C6）和柳氮磺胺吡啶（苯-d4）购自Alpha Analytical（新加坡），红霉素（N，N-二甲基-13C2）和（plusmn;）-氯霉素（环-d4，苄基-d1） 从剑桥同位素实验室（美国马萨诸塞州安多佛）购买。 在甲醇中制备单独的储备液和校准溶液，并储存在-20°C下。 乙酸铵和高效液相色谱（HPLC）级乙腈和甲醇购自Merck（Darmstadt，Germany）。 EDTA二水合四钠（Na4EDTA·2H2O）购自东京化学工业公司（日本东京）。 实验室试剂水是在ELGA Labwater水净化系统（英国，Wycombe）中制备的。

样品收集

地表水和土壤是从新加坡四个具有不同土地利用类型的地点收集的：公园，农业区，工业区和居民区。用两个2.5升的琥珀色玻璃瓶从河流和运河中收集地表水，然后用自来水，丙酮，甲醇和去离子水冲洗两次。从靠近水采样点的河岸采集土壤。用甲醇漂洗的铲子摘除草根和植物

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