葡萄糖作为强化生物除磷序批式反应器唯一碳源外文翻译资料

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葡萄糖作为强化生物除磷序批式反应器唯一碳源

CHE OK JEON and JONG MOON PARK*

Laboratory of Environmental Biotechnology, School of Environmental Engineering, POSTECH, San

31, Hyoja-dong, Pohang, Kyoungbuk, 790-784, South Korea

(First received 1 October 1998; accepted in revised form 1 August 1999)

摘要 ：以葡萄糖作为唯一碳源，研究厌氧/需氧分批反应器（SBR）中增强型生物除磷（EBPR）的代谢。 已经有几个报道声称，由于所谓的“G细菌”的主要生长，不能用葡萄糖进料作为碳源来完成EBPR，在厌氧条件下所述“G细菌”不累积多磷酸盐并且在没有正磷酸盐释放的情况下摄取葡萄糖 ，然而，在我们的工作中，甚至使用葡萄糖作为唯一的碳源可以实现高EBPR，根据和以前的报告完全不同的机制。

葡萄糖消失和糖原累积迅速发生，这与其他报告是一致的。 但正磷酸盐的释放和聚3-羟基链烷酸（PHA）的合成与总有机碳（TOC）浓度却不是葡萄糖浓度有关。在通过¹³ C-NMR光谱法追踪的厌氧阶段开始时供应所有¹³ C标记的葡萄糖来研究厌氧/需氧阶段中的葡萄糖的命运。结果表明，具有葡萄糖供应的EBPR至少由，乳酸生产生物体（LPO）和多磷酸盐累积生物体（PAO）两种微生物群体完成。 在厌氧阶段，从1 C-mmol葡萄糖合成约0.42-C mmol的PHA，而在pH 6.9释放0.12 P-mmol的磷酸盐。 磷酸盐释放的量与pH值成比例。合成的PHA的量小于加入的葡萄糖的量，因为除了通过PAO的PHA之外，通过LPO将葡萄糖转化为其它存储化合物（推断为乳酸聚合物）。 在有氧期，细胞中的PHA和储存化合物被代谢并产生磷酸盐吸收。 在这项工作中，提出PHA合成和磷去除的可能的代谢途径在提供葡萄糖作为唯一碳源的SBR。 ＃2000 Elsevier Science Ltd.保留所有权利

关键词 ：增强生物除磷，序批反应器，代谢途径，葡萄糖，聚3-羟基链烷酸

1 介绍

最近，富营养化已成为最重要的和全球性的水质污染源之一。 在水中的许多营养物质中，磷化合物已经被揭示为富营养化的主要原因。 在许多除磷方法中，生物系统被认为是最有效和最终的方法，并且最广泛地适用于真空除磷的操作。

自从能够累积过量多磷酸盐的生物体的第一次报告（Shrinath等人，1959）以来，已经进行了许多研究以便理解增强的生物除磷（EBPR）机制并实现稳定和有效的生物除磷过程。 尽管有这些发现，EBPR的确切机制因为它们的复杂性尚未很好地理解。

为了诱导EBPR活性，需要在厌氧和需氧或缺氧条件之间的替代物。 通常，负责EBPR（称为多磷酸（Poly-P）杆菌）的微生物能够储存作为内部储存化合物的有机化合物（短链挥发性脂肪酸[SCVFAs]）（聚3-羟基链烷酸[ PHA]），并利用在厌氧条件下由多磷酸盐降解成正磷酸盐产生的能量。在不存在外部碳底物的随后的有氧条件下，细菌使用存储的底物产生用于细胞生长和维持以及正磷酸盐从大量液体吸收的能量去构建多磷酸盐。 已经提出了各种生化模型（Comeau等人，1987; Wentzel等人，1986; Mino等人，1987）来解释EBPR机制，但是仍然存在一些争议。 这些模型验证了SCVFAs（特别是乙酸盐）在EBPR机制中作为底物起关键作用。

通常认为多聚磷酸微生物不能在EBPR系统的有氧条件下直接利用葡萄糖，此外，葡萄糖甚至对EBPR是有害的，除非它首先通过非多聚磷酸盐转化为SCVFAs 微生物（产酸细菌）（Randall等，1994）。 Cech和Hartman（1990）报告了当乙酸盐和葡萄糖作为碳底物供应时，由于“G-杆菌”的生长而导致的EBPR的分解。他们通过以下事实解释了细菌分解：当细菌含有葡萄糖时，G细菌主导厌氧/需氧过程，葡萄糖在有氧条件下不积累多磷酸盐，并且在有氧条件下能够吸收葡萄糖而不释放磷酸盐 （Cech和Hartman，1993; Satoh等，1994）。 因此，PHAs可以在没有能量缺陷的情况下合成，但在这些G-细菌中净产生1摩尔ATP。因此，在有氧/需氧系统中，G细菌可以在底物竞争中淹没多数P细菌，因为多磷酸盐对它们不是必需的。 Mino et al （1994）提出了一种代谢模型，支持由G-细菌分解EBPR。

另一方面，Tracy和Flammino（1987）提出，当葡萄糖作为糖原在厌氧条件下储存时，正磷酸盐可以通过多磷酸盐的水解释放。 储存的糖原通过有氧条件下的EMP途径和TCA循环代谢。所产生的过量ATP可以被聚-P微生物用于细胞物质和多磷酸盐的合成。 Nakamura et al（1991）报道，当葡萄糖和蛋白胨用作碳源时，微藻磷可以在厌氧条件下释放正磷酸盐并在需氧阶段积累多磷酸盐。 Carucci et al （1994）也报道了当作为碳底物提供葡萄糖和肽酶混合物时，在厌氧/有氧分批间歇反应器（SBR）系统中实现了良好的除磷效率，但在正磷酸盐的有氧释放期间没有检测到PHA或其他产物，葡萄糖的降低与正磷酸盐的释放没有关系。 然而，没有构建代谢途径或EBPR供应葡萄糖作为唯一碳源机制的报道。

NMR技术允许代谢途径的非侵入性研究。 用13C同位素标记的代谢物的特定原子（其仅有1.10％天然丰富）可以沿着代谢途径。 在这项工作中，我们应用这¹³ C核磁共振研究的葡萄糖在SBR系统操作的厌氧/有氧条件下的反应，并建议当葡萄糖作为唯一的碳源时的EBPR的代谢模型的代谢模型的命运。

2 材料和方法

SBR操作

接种种子获自POSTECH校园的活性污泥处理厂。 实验中使用的浓缩合成废水由有机和矿物溶液组成。 有机溶液每升含有1125mg葡萄糖和1.1252ml 1N NaOH溶液。 在1升蒸馏水中的痕量元素混合物营养液中含有0.3057gNH₄Cl，0.1318g KH₂PO₄，0.0696g MgCl₂，0.02114g CaCl₂，0.002g酵母提取物和1.4ml 1N H₂SO₄，0.6ml。微量元素混合物由0.90044g FeCl₃，0.15g H₃BO₃，0.03g CuSO₄ 5H ₂ O，0.18gKI，0.06g MnCl₂·4H₂O，0.12g ZnSO₄·7H₂O，0.15gCoCl ₂·7H₂O，0.06g Na₂MoO₄·2H₂O和10g 的蒸馏水。 COD（化学需氧量），NH₃-N和PO₃4yuml;-P对SBR的装载量分别为600,40和15mg / l。

具有4-l工作体积的填充 - 顺序间歇反应器（SBR）系统以8小时循环时间操作。 每个循环由15分钟填充，2小时厌氧，4小时20分钟有氧，60分钟沉降，15分钟取出和10分钟空闲阶段组成。 在沉降阶段结束时从反应器中取出2升澄清的上清液，在填充阶段期间将1升各有机和营养溶液泵入反应器中。 通过在需氧阶段结束时从反应器中取出污泥，将平均细胞停留时间（污泥龄）控制在约10天。 在厌氧阶段，通过在搅拌下鼓入氮气将反应器保持在厌氧条件下。 微管泵，空气泵，氮气供应和搅拌器装置用定时器控制，pH控制在6.9plusmn;8.0的范围内，使用水循环系统将温度控制在258℃。

批次实验

使用从上述葡萄糖进料SBR操作中取出的污泥进行补充分批培养以研究微生物的详细代谢。 具有500ml工作体积的夹套玻璃容器用于间歇实验。 在整个实验中控制温度（258℃），pH（6.9）和混合（150rpm），并使用氮气吹扫装置维持厌氧条件。 在需氧阶段结束时从SBR中取出的400ml活性污泥通过离心（1000g，5分钟，48℃）浓缩并重悬于200ml不含葡萄糖的新鲜矿物质溶液（pH6.9）中。 通过加入200ml葡萄糖溶液（562.5mg/l）开始厌氧实验，在分批培养开始时不存在硝酸盐。

在添加葡萄糖之前，将碘乙酸盐（一种选择性糖酵解抑制剂）加入到间歇式反应器中，以便于更详细地研究厌氧性葡萄糖代谢和通过多磷酸盐用于糖原储存的能量供应。 碘乙酸的最终浓度为1mM。 在另一种分批培养中，使用L-乳酸（100mg/l）代替葡萄糖以研究多磷酸盐累积生物体（PAO）的代谢。

为了研究乳酸的代谢（LPO），在厌氧分批培养10分钟后从玻璃容器中取出污泥，并离心以除去LPO产生的乳酸。 将离心的污泥再悬浮于400ml新鲜半强度矿物质溶液中，并在氮气吹扫除去氧气后恢复厌氧操作。 使用13 C 6标记的D-葡萄糖（99原子％，Sigma-Aldrich）溶液（581.25mg/l）在13 C-NMR的厌氧分批培养过程中追踪葡萄糖的反应。

分析

从SBR取样的活性污泥通过Watmann GF / C玻璃微纤维过滤器（1.2mm孔径）立即过滤，并在100℃下干燥5小时，以测量混合液悬浮固体（MLSS）的浓度。 对于细胞糖原，PHA和体内NMR的分析，立即向污泥样品中加入几滴1N硫酸溶液以终止细菌活性。 将污泥样品通过Whatman GF/C玻璃微纤维过滤器过滤并完全冻干。 使用DX-120离子色谱仪（Dionex，USA）分析溶液中NOyuml;3-N，NOyuml;2-N和PO34yuml;-P的浓度，并使用TOC分析仪（Shimadzu TOC-500， 日本）。

为了分析细胞中的PHA，将冻干的污泥样品消化，甲基化，并根据Comeau等人的方法用氯仿提取。 （1988）。 使用配备有SUPELCO蜡柱（长30m，内径0.25mm，膜厚度1.0mm）的气相色谱系统（Hewlett Packard 6890，USA），一种电离检测器分析提取的甲酯的组成， 和自动采样器。 使用氦气作为载气（30cm / s）和补充气体。 使用FISON 8000系列和Platform II（Micromass，UK）进行结构确认和PHA来源的GC / MS分析。

糖原的分析如其他地方所述进行（Smolders等人，1994; Brdjannovic等人，1998）。 将冻干的污泥样品在0.6N HCl水溶液中在100℃下消化1小时。 冷却和过滤后，使用具有CarboPac PA1柱（Dionex），0.1N NaOH水溶液作为洗脱剂的HPLC（Dionex，USA）和脉冲安培计检测器适当稀释后分析滤液。 还使用相同的HPLC系统和具有糖原分析的操作条件分析溶剂中的葡萄糖。

¹³C-NMR谱的获得

使用在75MHz操作的Bruker AMX-300光谱仪中的四核核酸探针头（5mm直径）获得¹³C-NMR光谱。 为了获得上清液的13 C-NMR谱，加入D₂O（5％）作为信号锁定器和¹³C-标记的甲酸（1.3823mg-C/1当量）作为内标。 为了获得细胞的¹³C-NMR谱，将冷冻干燥的细胞用含有13 C标记的甲酸的D 2 O悬浮，每个样品的数据采集时间为约8小时。

结果

SBR的长期运行

将葡萄糖作为唯一碳源供给的SBR的长期操作持续250天。 磷酸盐释放和去除效率随时间逐渐增加。 约70到80天后，磷酸盐去除效率几乎达到100％。 在SBR操作的早期，葡萄糖仍然保留直到厌氧阶段结束。随着SBR操作的继续，葡萄糖摄取速率增加，并且最终在90天达到高增强的生物除磷（EBPR）; 加入的葡萄糖几乎立即被微生物摄取。

图1 SBR在长期运行中的磷酸盐和硝酸盐分布的典型周期（R: ortho-phosphate; r: nitrate）。

图1显示了在EBPR建立（116天）后SBR的典型循环中的磷酸盐和硝酸盐分布。其他重要化合物如总有机碳（TOC），PHA（3-羟基丁酸[3HB]，3-羟基戊酸[3HV]，3-羟基-2-甲基丁酸[3H 2 MB]和3-羟基-2-甲基戊酸[3H 2 M]）和糖原。细胞中糖原和PHA含量的变化以及这种葡萄糖进料的SBR中磷酸盐释放量的变化远小于作为碳源提供的乙酸的其它SBR，循环模式也不同（乙酸盐喂养SBR数据未示出）。在该SBR中，3HV单元是构成在无氧阶段期间积累的PHA（摩尔百分比，3HB：3HV：3H2MB：3H2MV = 23.35:60.05:6.39:10.21）的主要单元，而PHA主要由乙酸中的3HB单元（以摩尔百分比比率，3HB：3HV：3H2MB：3H2MV = 84.04:12.68:2.40:0.88）。细胞中糖原变化的模式也彼此不同。在乙酸酯喂养的SBR

图2 TOC，PHAs的典型周期，和糖原分布SBR喂以葡萄糖作为唯一碳源的长期运行(Q: glycogen; r: TOC; R: PHAs).

操作中，细胞中糖原量在厌氧阶段减少，在有氧阶段增加（图3），这与Mino等人报道的模型一致。 （1987），其解释了通过在好氧阶段期间储存的细胞内糖原的降解来提供PHA合成所需的还原能力。 在葡萄糖喂

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