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附录A 外文参考文献（译文）

结肠扩展的基于生理的提取试验（CE-PBET）增加了土壤结合的PAH的生物可及性

E. L. Tilston,^{dagger;,sect;} G. R. Gibson,^Dagger; and C. D. Collins*^,dagger;

^dagger;Soil Research Centre, University of Reading, Reading, RG6 6DW, U.K.

^Dagger;Department of Food and Nutritional Sciences, University of Reading, Reading, RG6 6AH, U.K.

摘要 如果依赖总污染物浓度，可能会严重高估对受污染土地造成的人类健康风险的评估。体外提取测试，例如基于生理学的提取测试（PBET），可模拟人体胃肠道的理化条件，并为常规测试目的提供了更实用的替代方法。然而，即使通过结肠占人体消化道运输时间的大约80％，并且结肠在体内的典型组分是富含碳水化合物的水溶液介质，具有促进有机污染物解吸的潜力，但PBET仅包含胃和小肠隔室。通过在PBET模型的基础上增加1个8小时的结肠隔室，并利用富含碳水化合物的介质模拟摄食状态，我们证明了结肠扩展的PBET模型（CE-PBET）在实验室土壤中将对土壤结合的PAH生物可及性的评估提高了50％，在田间土壤中提高了4倍。我们把生物可及性的增加归因于附加的提取时间和结肠隔室中碳水化合物的存在，两者均有利于PAH从土壤中解吸。我们建议，将来使用基于生理学的提取试验评估土壤中有机污染物的生物可及性时，应像在CE-PBET中那样使用结肠隔室。

1 引言

总污染物浓度经常用于评估受污染土地对人类健康构成的风险。尽管这样做具有预防的优势，但它可能会大大高估了包括人类在内的生物群吸收的污染物量。对风险的这种高估可能会导致大量额外的清理成本，从而降低棕地修复的可持续性，因此，开发了许多分析方法来测量可能的污染物暴露。使用大鼠^[1]或猪^[2]的体内方法能够对生物利用污染物的分数进行实际测量，即在任何给定时间可通过生物体细胞膜吸收的分数^[3]。然而，使用哺乳动物的伦理学考虑以及高成本和低样品通量的实际缺点，使这些方法不适合常规测试。无脊椎动物比哺乳动物^[4]更实用的测试生物，但它们的区别在于生理学和生态学损害了污染物的外推对人类的生物利用度。

人类接触污染土壤的主要来源之一是通过手到嘴的活动直接摄入，以及几种基于生理的体外提取试验。^[5-8]体外替代品是生物利用度测定的一种较便宜的前体，但它们的持续时间较短，意味着它们只能提供有关生物可利用成分的信息，即从土壤基质释放到肠液中的信息。^[3]迄今为止，这些系统主要用于评估痕量元素污染的生物可及性。^[5,9,10]尽管有机污染物同样普遍存，一些数字经常出现在目标清单中，例如《斯德哥尔摩公约》(http://chm.pops.int/default.aspx)，但与有机污染物相比较的工作更为有限。^1,11-13多环芳烃（PAH）是无处不在的环境有机污染物，来自石油工业、旧煤气厂和许多其他燃烧源。土壤是多环芳烃的主要环境汇聚地，据估计，英国90％以上的多环芳烃最终归趋是土壤¹⁴。

用于测量暴露于基质结合的污染物的胃肠提取系统 通常包括一个或多个维持在体温（37°C）的“隔室”，基本上由pH，暴露时间和生物化合物的包涵性决定。口腔和食道的停留时间 少于2分钟，并且对生物可及性没有显着影响。¹⁵因此，胃肠道提取测试，例如基于生理的提取测试（PBET）⁵，始于暴露于胃中1小时，然后暴露于小肠4小时。即使某些营养物质的吸收，特别是具有共生活性的发酵产物在结肠中被吸收¹⁶，Cavret等人¹⁷也证明了多环芳烃可以穿过结肠上皮细胞系Caco-2的细胞膜。只有少数几种模型包含结肠，例如SHIME。¹⁸除了延长提取时间外，由于结肠介质中含有肽，碳水化合物和胆汁，因此它本身有望增加PAH从土壤中的解吸。所有这些盐都可以吸收有机污染物。^11,19,20

这项研究的目的是通过在PBET中增加一个结肠隔室， 开发出一种用于评估持久性有机污染物生物可及性的强大系统。结肠延伸的PBET（CE-PBET）系统的开发涉 及三个方面。首先，评估了用于CE-PBET的非进料和进料状态的培养基；其次，确定结肠隔室的最佳暴露时间，并以分批和顺序模式对系统进行表征和测试，并鉴定出一些促进PAH解吸的培养基成分。最后，CE- PBET用于确定田间土壤的生物可及性。

2 材料和方法

2.1 肠胃提取

胃肠道提取试验包括三个部分，特别是胃， 小肠和结肠（表1）。在130毫升容量的玻璃瓶中进行孵育，然后将玻璃瓶置于摇动的水浴中

37℃.将土壤（1 g d.w.）添加到预热30分钟的100 mL培养基中。多环芳烃是半挥发性的，因此孵育容器未如Ruby 等人⁵所述连续注入N₂ ，而是在孵育期间用特氟隆衬里的螺帽密封。在单独的实验中证实了瓶及其密封件的 完整性，在该实验中，将等分的培养基中掺入了7种PAH在丙酮中的混合物（表S1，支持信息（SI））。没有重大意义添加加标后或孵育8小时后立即提取的单个多环芳烃数量的差异。

表1 结肠扩展P-BET（CE-PBET）提取测试中每个室的物理化学定义

操作有两种形式的提取测试：（a）分批进行，其中测试底物单独暴露于每个隔室；（b）顺序进行，其中测试底物连续暴露于三个隔室。在顺序形式，暴露于胃和小肠区室是通过将测试底物暴露于胃而实现的，在将胃介质转化为小肠介质之前，先隔1小时。然后将瓶重新密封，并继续孵育另外4小时。小肠和结肠腔室之间的过渡通过物理转移实现：通过离心回收受试基质（3000g，10分钟），加入到一瓶预热的结肠培养基中，并再温育8小时。

2.2 培养基

胃部培养基基于PBET⁵中使用的非进料状态培养基，其小肠通过添加胆汁盐和胰酶并调节pH来创建。饲喂状态的结肠培养基是Macfarlane等人使用的培养基²¹已针对人类猝死受害者²²的肠道内容进行了验证（表S2， S1）。对于未进料状态的结肠培养基，饮食成分被省略，同样包含进料状态的胃和小肠培养基。虽然原始PBET培养基中未包括，但胃和小肠隔室的培养基中均包含4.0 g L^-1粘蛋白和800 mg L^-1半胱氨酸盐酸盐。粘蛋白存在于整个胃肠道²³，而盐酸半胱氨酸是用于促进厌氧条件建立的还原剂²⁴。

分析级无机盐（Fisher Scientific，Loughbor-ough,U.K.），所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich（Gillingham,U.K.）。

2.3 PAH提取

通过离心将每个培养瓶的内容物分离成固体（土壤和颗粒介质成分）和液相。溶液中的多环芳烃通过在初步工作中优化的单液液萃取进行萃取；简短地，将2 mL上清液移至10 mL容量的圆底玻璃培养管中，该培养管带有特氟隆衬里的螺帽，4 mL的5至4丙酮-己烷萃取剂（GLC，农药残留等级，Fisher Scientific）， 加入作为内部标准的500mu;gmL-1 联苯（Alfa Aesar， Heysham，UK），并将试管中的内容物以1600 rpm涡旋1分钟。然后将试管静置15分钟，在此期间粘蛋白沉淀且未表征的不稳定乳液分离为水相和己烷相。然后将己烷相转移到GC小瓶中，并保存在20°C直至分析。将沉淀物（土壤和不溶性介质成分）在置于摇床上的玻璃小瓶中，用4 mL 5：4丙酮己烷萃取剂萃取20分钟，然后加入2 mL蒸馏水以促进多环芳烃分配到己烷组分中，然后-将小瓶放回摇床，再静置5分钟。从不同CEPBET隔室中使用的加标溶液中回收单个PAH的范围为50.1至96.0，平均值为76.2（表S1）。

2.4 气相色谱法

己烷正己烷萃取物中的多环芳烃沉淀通过配备30 mtimes;320mu;mtimes;0.25mu;m 5％苯基甲基硅氧烷毛细管柱（ AgilenXt,SantaXClara,CA）的Agilent 6890N气相色谱仪进行定量。CombiPAL（(CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）自动进样器向进样口（300°C）中引入了2mu;L，进样口采用不分流模式。温度程序为50°C，在15.3°Cmin^-1至280°C，保持15分钟。载气为至少2 mL min^-1的 氦气。在300°C下用FID检测各个PAH，并根据保留在己烷中的纯化合物的保留时间和峰面积进行鉴定和定量。

从上清液等分试样中提取的多环芳烃通过配备有5％苯基甲基硅氧烷毛细管柱（30 mtimes; 250mu;mtimes;0.5mu;m）的Agilent 7890AnotworkGC系统进行定量，并与在单离子监测（SIM） 模式下运行的Agilent 5975C质谱仪耦合， 如Gomez- Eyles等人所述²⁵使用GC-FID分析的检出限为：萘为22mu;gg^-1 土壤，所有其他PAH为5mu;gg^-1土壤; GC-MS分析的检出限为400mu;gL^-1萘介质和100mu;g L^-1所有其他PAH的培养基。