2014-2015年法国门诊儿童柯萨奇病毒A6所致手足口病感染暴发疫情监测分析外文翻译资料

2014-2015年法国门诊儿童柯萨奇病毒A6所致手足口病感染暴发疫情监测分析

——Audrey Mirand，Franccedil;oisVieacute;leSage，Bruno Pereira，Robert Cohen，Corinne Levy，Christine Archimbaud，Heacute;legrave;nePeigue-Lafeuille，Jean-Luc Bailly，Ceacute;cileHenquell

Ambulatory Pediatric Surveillanceof Hand, Foot and Mouth Diseaseas Signal of an Outbreak ofCoxsackievirus A6 I nfections,France, 2014- 2015

摘要：背景 目前，除了亚洲以外，世界各地与手足口病（HFMD）相关的肠道病毒的临床影响尚不清楚，尤其是肠道病毒A71（EV-A71）的流行可能被低估了。目的 为了调查法国血清型肠道病毒的流行情况和与手足口病相关的临床表现。方法 2014年4月至2015年3月期间对儿童进行了前瞻性门诊临床监测，从患有手足口病的儿童中收集咽喉或口腔拭子检测肠道病毒基因组，以标准化形式记录体格检查结果。在659名接受测试的儿童中，523名（79.3％）检测到肠道病毒感染。在53.9％的肠道病毒感染儿童中检测到发生了两次流行波，以柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）A6为主。结果 CV-A6更多与非典型手足口病表现有关（症状蔓延到四肢和面部）。结论 通过门诊儿科医生对手足口病进行综合症监测以及快速肠道病毒检测和基因分型，可以实现对手足口病暴发的早期认识和记录。

1.前言

尽管大多数肠道病毒感染的临床儿童表现出普遍的无症状或自限性，但可能还是需要就医。血清型肠道病毒的定期出现与更严重的疾病暴发相关，导致患者患严重疾病甚至死亡。最近的例子是肠道病毒A71（EV-A71）的出现，这是造成亚洲罕见且严重的脑炎和手足口病（HFMD）大暴发，以及与严重呼吸道感染相关的EV-D68流行病的原因^[1,2]。监测肠道病毒感染并提供与临床表现相关的不同血清型，进行实验室确认对于早期检测和对新出现的肠道病毒感染的认识具有重要价值^[3-4]。

EV-A71被认为是东南亚国家最重要的神经性肠道病毒，EV-A71疫苗早已在中国开发^[5,6]。 EV-A71感染以及属于肠道病毒A（EV-A）^[7]的其它血清型肠道病毒主要与手足口病相关，手足口病的特征是儿童短暂的发热性疾病和典型的皮疹，有或没有口腔溃疡^[8]。 EV-A71和柯萨奇病毒（CV）A16是1998 - 2010年期间整个亚洲HFMD暴发中最常见的血清型^[1,9]。然而，在过去的5年中，CV-A6已成为全球新的重要病原体^[10-19]，并且一些研究已经证实了CV-A6 HFMD^[16,20-25]的更严重性和广泛的皮肤病学表现。对HFMD的监测可以更好地检测EV-A71或不典型相关的其它血清型病毒特异的、高发的临床特征。在西方国家，病毒学实验室对肠道病毒感染进行监测，但仅限于入院的肠道病毒感染者^[19,26]。患有HFMD或疱疹性咽峡炎的儿童通常在门诊环境中进行评估和管理，很少进行病毒学检查。所以，对于亚洲以外国家手足口病和疱疹病毒以及肠道病毒的流行病学和临床知识存在明显差距。因此，我们建立了一个由门诊儿科医生在治疗环境中负责填报、运行的本地监测系统，该系统可有效检测HFMD暴发和相关的血清型肠道病毒^[13]。现在，监测范围已扩展到整个法国。本研究的目的是描述与法国手足口病和疱疹病毒相关的血清型肠道病毒的流行病学，并根据血清型肠道病毒比较了手足口病和疱疹病毒的临床特征。

2.方法

2.1研究对象与设计

该研究对2014年4月至2015年3月期间由儿科医生观察的手足口病或疱疹性腹膜炎患儿进行了为期1年的前瞻性调查。通过来自法国不同地区的118名志愿者中，分层抽样选出了47名儿科医生，进行了22个法国行政区域中的20个区域为代表的哨点监测。要求哨点儿科医生从临床诊断为HFMD 或疱疹性咽峡炎的儿童中收集咽喉或颊拭子标本。HFMD的定义是出现下列2种以上症状：颊部或脓肿周围溃疡；手掌，脚掌，臀部，蔓延至膝盖、肘部或全身广泛性发疹。 疱疹性咽峡炎的定义是口腔后部的口腔溃疡。标准化病例报告表收集了患者人口统计学的匿名信息（例如，出生日期和性别）；出现的临床症状，包括发烧，蔓延发疹类型和部位（如手掌，脚掌，臀部，膝盖，肘部，下肢，上肢，全身或任何其他部位），咽颊炎或脓肿性溃疡，牙龈炎，疱疹性咽炎和消化/呼吸/耳，鼻，喉/神经系统体征； 疾病的发病日期和样品采集日期。还记录了环境数据（例如，兄弟姐妹的数量，在学校或日托中心的出勤情况以及不良接触史），其中发热定义为直肠温度gt; 38℃。在检查项目的基础上，典型的手足口病定义为：世界卫生组织^[8]手足口病定义中列出的gt; 2项以下症状：口腔溃疡，手掌，臀部，膝盖，蔓延至膝盖或肘部。如果在世界卫生组织手足口病定义中没有列出的解剖部位发生蔓延，或者大面积发生，则临床症状被认为是非典型的手足口病。

所有参与者的父母或监护人都获得了书面知情同意书，但未获得相关津贴。该研究得到了法国ClermontFerrand大学医院伦理审查委员会（参考AU1098）以及法国国家药品和健康产品安全局（参考文献140021-B41）的批准。

2.2样品采集

用植绒收集咽喉或颊部标本拭子放置在通用的病毒运输系统中（Copan ，意大利， s.p.a., Brescia, 意大利）。取样后，将拭子在2℃-8℃保存，每周送至国家肠道病毒和细小病毒参考实验室（(Clermont-Ferrand, 法国）进行肠道病毒检测。

2.3临床标本中肠道病毒感染的诊断及菌株的分子分型

根据专门制定的B方案（洗脱体积50mu;L），在NucliSens easyMAG自动化系统（bioMeacute;rieux，Marcy lEtoile，法国）上的病毒转运培养基，从200mu;L样品中提取病毒RNA。通过实时逆转录PCR（RT-PCR）（肠道病毒R基因，bioMeacute;rieux）进行肠道病毒诊断。首先通过半巢式RT-PCR进行分子分型（图1，图A），使用专门针对EV-A类型（RT-PCR A）开发的肠道病毒基因组引物，其靶向病毒蛋白（VP）为3-VP1编码区。然后使用引物HEVAS1405（5-GGNTCNTTYATGGCNACNGGNAARATG-3，lo-）进行第一轮RT-PCR EV-A测定，终体积为25mu;L。

3.系统发育分析

为了研究病毒变体之间的时空关系，将分配给血清型肠道病毒CV-A6的核苷酸VP1序列与公共数据库中可用的同源序列进行比较。剔除了来自369个核苷酸的238个序列的最终比对的冗余序列（即在该研究中确定的159个序列和79个可公开获得的序列）。

图1 2014年4月至2015年3月，法国，手足口病和疱疹性咽峡炎相关类型的肠道病毒基因分型和分布的方法学

方法.A）使用针对属于EV-A物种的肠道病毒类型专门开发的引物的半巢式逆转录PCR（RT-PCR）A，首先针对除1之外的所有临床样品进行。对于该样品，病毒载量低，并且Nix等人报道了嵌套的RT-PCR^[27]可以直接进行。如果半定型RT-PCR A为阴性，则通过半巢式RT-PCR B交替进行基因分型，其中使用对EV-B物种特异的引物^[28]或巢式RT-PCR^[27]。

方法.B）在其他EV-A物种中，鉴定了5种不同类型：柯萨奇病毒（CV）A4，n = 18； CV-A8，n = 16；CV-A2和CV-A5，每个n = 5；在EV-B物种中，鉴定出12种不同类型：埃可病毒E-16、E-18（各自n = 5）和CV-A12（n = 1）； E-11和柯萨奇病毒B3（CV-B3；每个n = 4）； CV-B1，CV-B2，CV-B4，CV-A9和E-6（每个n = 2）；和E-3，E-5和E-25（n =每个1）。 EV-A，肠道病毒A； EV-A71，肠道病毒A71； EV-B，肠道病毒B；RT-PCR，逆转录PCR。

3.1统计分析

使用Stata 13软件（StataCorp LP，College Station，TX，USA）进行统计分析。双侧检验，I型误差设置为alpha;= 0.05。患者特征用连续数据的平均值（plusmn;SD）（经Shapiro-Wilk检验呈正态分布）以及患者数量和分类指标的构成百分比描述。根据统计分布和流行病学相关性将患者分为4个年龄组：1）lt;1岁，2）2岁gt; 1岁，3）2至lt;3岁，4）gt; 3岁。采用Fisher精确检验对分类变量和方差分析（ANOVA）或Krus-kall-Wallis检验进行定量比较各独立组。单因素分析选取合适条件的ANOVA或Kruskall-Wallis检验：p lt;0.05），多因素分析检验方法为ANOVA的Tukey-Kramer和Kruskall-Wallis检验以及Dunnt检验）且进行多重比较，特别是对于年龄类别之间的比较。 进行多变量分析（二分类自变量的逻辑回归）以考虑根据单变量结果和临床相关性进行固定协变量的调整。

4.结果

在参加该研究的659名儿童中，523名（79.3％）患有肠道病毒感染。 10名患者在研究期间经历了2次HFMD /疱疹性咽峡炎事件，并收集了他们标本；有7名儿童存在连续2次肠道病毒感染与不同血清型相关，时间间隔3周至5.5个月。对于其他3名患者，仅1次发疹与肠道病毒感染有关。

总体而言，分析了669个样本，其中530个（79.2％，95％CI 75.9-82.2）检测为肠道病毒阳性（图2）。儿科医生监测报告的平均患者肠道病毒阳性率为75.1％（范围50.0％-88.9％）。肠道病毒相关的HFMD /疱疹性咽峡炎在两年间的初夏（第25-27周）和秋季（第42周）表现出发病高峰（图3）。

527/530例（99.4％）已鉴定证实感染的是血清型肠道病毒。最常见的EV-A血清型是CV-A6（286 / 530,33.9％），其次是CV-A16（123 / 530,23.2％），CV-A10（39 / 530,7.3％），CV-A4（18 ，3.3％），CV-A8（16,3.0％），CV-A2（5,0.9％）和CV-A5（5,0.9％）； 1例感染是CV-A12（图1，图B）。确定了12种EV-B血清型：埃可病毒16（E-16）和E-18（每个5个）；E-11和柯萨奇病毒B3（CVB3）（每个4个）； CV-B1，CV-B2，CV-B4，CV-A9和E-6（各2个）和E-3，E-5和E-25（每个1个）。其中CV-A6在两次流行期间都占主导地位。检测到6例EV-A71感染，多数与典型的手足口病相关（5 /6,83.3％）。有一名患者出现全身发疹，仅有2/6的患者报告了发烧。EV-A71菌株属于亚基因型C2（n = 5）和C4（n = 1）。C4菌株是在一名正在法国旅游的来自中国广州的3岁儿童身上发现的（数据未完整报告）。

肠道病毒感染儿童的平均年龄为2.1岁（范围：1个月-10.5岁）。感染率最高的是1-2岁儿童。397/530（74.9％）的肠道病毒感染型儿童出现了发烧症状。在456/530（86％）儿童中观察到皮疹，并且从手掌，脚底，臀部和肘部出疹逐渐减少。HFMD是主要的临床表现（342 / 530,64.5％），304/530（57.4％）病例报告了有疱疹性咽峡炎，有手足口病相关临床表现的为241/304（79.2％）。四肢（188 / 530例,35.4％）和面部（口周和耳垂，161 / 530,30.4％）也经常观察到病变。247/530（46.6％）儿童中观察到非典型HFMD（表1）。肠道病毒感染儿童的比例在典型手足口病患儿和非典型手足口病患儿之间没有显著差异，其中，典型的手足口病占（95 / 116,81.9％），非典型手足口病占（247 / 281,87.9％）。

图2 2014年4月至2015年3月法国手足口病和疱疹性咽峡炎监测肠道病毒检测的参与者流程图.RT-PCR，逆转录PCR。

图3 2014年4月至2015年3月法国手足口病和疱疹性咽峡炎相关的肠道病毒感染的每周分布，条形图代表分析的肠道病毒阳性（深灰色）和阴性（白色）样品的数量。

表1 与非CV-A6感染患者相比，CV-A6感染患者的人口统计学和临床特征