原发结肠癌与同期独立性肝转移的蛋白组学分析外文翻译资料

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附录A 译文

原发结肠癌与同期独立性肝转移的蛋白组学分析

EUN-KYUNG KIM1, MIN-JEONG SONG1, YUNJAE JUNG2, WON-SUK LEE3 and HO HEE JANG1

1. Lee Gil Ya 癌症与糖尿病研究所医学院生物化学系，韩国仁川嘉川大学；
2. 大韩民国仁川嘉川大学医学院微生物学系；
3. 大韩民国仁川加川大学吉尔医学中心外科；

摘要

结肠癌易从远处转移到其他部位，且复发的风险相对较高。因此，肝转移相关因子的识别对于结肠癌的诊断和治疗具有重要意义。本研究的目的是确定同期独立性肝转移与原发结肠癌之间差异表达的转移相关因子。材料与方法：对5例病人的原发结肠癌组织及相关肝转移组织进行质谱分析。通过western blotting方法对识别到的蛋白进行检验。使用STRING数据库和GeneMANIA数据库对其组织进行硅含量分析。结果：在164个蛋白中鉴定出58个差异表达蛋白（DEPs），其中有51个低表达蛋白和7个高表达蛋白。蛋白-蛋白网络的主要枢纽是ACTC1、PRDX6、TPI1和ALDH1A1。位于胞外区和细胞质中的DEPs，参与酶活性的调控。代谢过程在生物过程中显著富集，并参与KEGG通路。结论：这些DEPs有可能作为结肠癌肝转移诊断的生物标志物，为结肠癌患者开发抗肝转移药物提供了新的解决方法。

关键词 结肠癌，差异表达蛋白质，GO分析，肝转移癌，质谱分析，蛋白质相互作用

结肠和直肠是最常见的癌症易发器官之一，韩国男性和女性的高死亡率与这些部位的恶性肿瘤息息相关（1）。肿瘤的转移是影响阶段IV结肠癌化疗反应性和临床结果的关键因素。超过50%的结直肠癌患者要么在诊断时就发生肝转移，要么在不久后发生转移（2-4）。目前，肝切除手术被认为是限制性肝转移结直肠癌最有效的治疗方法。然而，与蛋白质组学特征相关的治疗异质性实验性证明是有限的，不充足的。

转移性癌症的过程降低了E-cadherin或ZO-1的水平，升高了N-cadherin、vimentin、Snail和Slug的水平（5,6）。这些特征在研究领域是已知的，主要是由于结果的准确性以及技术上的限制，导致这些因素大多难以应用于临床人类活检样本。因此，易得的结肠癌生物标志物或药物靶点对于用来提出合适的治疗或诊断指南的肝转移预测研究是有必要的，。利用二维（2D）的差异凝胶电泳和质谱技术检测了9种蛋白在SW620和SW480转移性结直肠癌细胞株中的表达水平（7），同时使用蛋白质组学技术进行了患者样本的细胞外基质富集分析（8）。这些研究主要集中在差异表达蛋白（DEPs）上，它们在原发性结肠癌中的表达不同于在正常结肠中的表达。然而，目前通过原发结肠癌和同期独立性肝转移的差异分析来鉴别DEPs的研究较少。

为了寻找肝转移的相关因素，我们的研究集中在肝转移中DEPs的质谱分析上。比较原发性结肠癌和肝转移癌的差异表达情况。我们的研究表明DEPs的鉴定为抗肝转移药物提供了一套潜在的诊断生物标志物和可能的靶点。

表一 结肠癌肝转移患者的临床病理特征用于蛋白质组学分析

材料和方法

材料。所有化学品（碘乙酰胺、4-硫苯基异硫氰酸盐、乙腈、a-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、碳酸氢钠、尿素、双丙烯酰胺、三氟乙酸、硫脲、碳酸氢铵、布拉德福德溶液、丙烯酰胺、3-[（3-胆胺丙基）二甲基氨]-1-丙磺酸盐（CHAPS）、SDS、DTT、苯甲脒、和alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸）均为电泳或分析级，购自Sigma（St. Louis，MO，USA）。Pharmalyte（pH 3.5-10）购自Amersham Biosciences（Piscataway, NJ, USA）。测序级改良猪胰蛋白酶购自Promega（Madison，WI, USA）。抗碳酸酐酶1（CA1, sc-393490）、Serpin A1（sc-59438）、n-乙酰神经氨酸合成酶（NANS，sc-374133）、转铁蛋白（sc-365871）、GAPDH（sc-47724）的抗体均购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。

活检样本。在调查之前，研究方案已经通过了Gachon大学（IBR No. GIRBA2216）Gil医院的机构委员会的审查。所有参与者均获得书面知情同意。这些样本是2015年6月至2017年6月期间在Gachon大学Gil医院提取的。肝转移样本的合格标准如下：i）经腹盆螺旋ct及肝MRI证实为同期结肠癌及单发肝转移，ii）正电子发射断层扫描后未见体层摄影及其他转移，iii）M1病以肝转移为首发表现，术前无传染性疾病，iv）无肝脏特异性治疗史，v）组织学证实为结直肠癌，vi）年龄大于18岁。25例肝切除术患者中有5例符合这些标准并进行了分析。其特点见表1。

蛋白质组学的蛋白质样品制备。使用PowerGen125均质器（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA, USA），在样品溶解液中溶解的组织样品（2%的pharmalyte，2M硫脲，4%（w/v）CHAPS，1mM苯甲脒，1%二硫苏糖醇和7M尿素）。蛋白在室温下旋转10分钟后提取。样品在15˚C，15,000 times; g条件下离心1小时。随后，不溶性组分被丢弃，可溶性物质使用2D凝胶电泳分析。采用Bradford法分析蛋白浓度（9）。

二维页面和图像分析。从每个样品中提取200 mu;g，装在IPG干条（24cm，4-10 NL IPG，Genomine，Korea）中，用条液（1% pharmalyte，1% DTT，7 M尿素和2 M硫脲，2% CHAPS）平衡12-16小时。按照制造商的说明，在20˚C下使用Multiphor II电泳系统和电源（EPS 3500xl，Amersham Biosciences）进行等电聚焦操作。等电聚焦时，进入样品后3小时内，电压从150 V线性增加到3500 V，然后持续施加保持在3500 V，96 kVh后聚焦完成。在2D凝胶分析之前，条带在平衡缓冲液（6 M尿素，30%甘油，50 mM Tris-Cl，pH 6.8，2% SDS）中培养10分钟，首先用1% DTT，其次用2.5%碘乙酰胺。将平衡条包埋在SDS-PAGE凝胶（10-16%，20times;24 cm）上。根据制造商说明，使用Hoefer DALT 2D系统（Amersham Biosciences）进行SDS-PAGE凝胶测试。在20˚C下进行1700 Vh的2D凝胶分析，然后使用考马斯亮蓝G250（CBB）（10）进行染色，省去戊二醛固定和敏感化步骤。

根据制造商的协议，使用PDQuest（version 7.0，BioRad，Hercules，CA，USA）对数字化图像进行定量分析。每个斑点的数量由总有效斑点强度统一化。关于显著表达分析，选择与正常样品相比偏离表达水平两倍以上的蛋白斑点。

质谱分析和热图分析。蛋白斑点被切割出来，用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶化蛋白斑点与alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸混合，在50%乙腈/0.1% TFA中进行肽质量指纹分析鉴定，并采用Microflex LRF 20 MALDI-TOF分析技术（Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA）（11）。

在m/z范围为600-3000范围内，每个光谱拍摄300次，并通过胰蛋白酶自动消化峰（m/z 842.5099，2211.1046）进行两点内校正。使用Flex Analysis 3.0（Bruker Daltonics）创建了一个峰值列表。单同位素质量的最小分辨率为500，S/N为5。利用Matrixscience （http://www.matrixscience.com/）开发的MASCOT搜索程序，识别通过肽质量指纹法得到的蛋白质。在数据库搜索中使用了以下参数：i）胰蛋白酶消化，ii）单次最大差异丢失，iii）2-碘乙酰胺（Cys）的完全修饰，iv）氧化（Met）作为部分修饰，v）单同位素质量，vi）质量耐受plusmn;0.1 Da。概率评分计算采用PMF接受标准。利用在线Heatmapper软件平均链式聚类生成58个DEPs的热图（http://www.heatmapper.ca/）（12, 13）。

图1 5例原发结肠癌和同期独立性肝转移癌的2D-PAGE凝胶。2D-PAGE后Coommassie蓝染色表示原发结肠癌和同期独立性肝转移组织的蛋白表达模式

Western blotting。样品提取液在由50 mM Tris （pH 8.0）、1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1% SDS、150 mM NaCl和1X蛋白酶抑制剂混合物（GenDEPOT，Barker，TX，USA）组成的RIPA裂解缓冲液中进行裂解。

利用STRING分析蛋白质相互作用（PPI）和GO分析。使用STRING软件[v10.5，http://string-db.org，（14）]对58个鉴定出的dep进行分析和可视化预测PPI分析，该软件使用多种蛋白质的搜索工具。来自STRING数据库的网络数据显示了数据的组合，包括文本挖掘、邻域、共表达、共现、基因融合和实验。最低要求的互作分数为中等置信度（0.400）。使用GeneMANIA（15,16）分析58个DEPs的通路。

利用STRING的GO分析对DEPs进行功能富集分类。我们从以下几个方面分析了58个DEPs的网络：i）细胞成分，ii）分子功能，iii）生物过程，iv）KEGG通路。

结论

原发结肠癌与肝转移癌差异表达蛋白的鉴定。为了识别肝转移性结肠癌的特殊生物标志物，在2D-PAGE凝胶上对原发结肠癌和肝转移性癌的组织裂解物进行了分离（图1）。用质谱法对提取的多肽进行分析。共有164个个体斑点显示原发性结肠癌和同期独立性肝转移之间存在DEPs。与原发结肠癌相比，7例DEPs有更高的同期独立性肝转移性（表II）。与原发结肠癌相比，51例DEPs在肝转移中的表达较低。图2为原发结肠癌和肝转移性结肠癌蛋白差异表达的热图。

肝转移相关因素的Western blotting分析。为了验证质谱分析的结果，我们进行了肝转移相关蛋白的western blotting检测（图3）。我们随机选择两个增加和减少蛋白质的因素。Serpin A1和CA1是肝转移中表达上调的代表性标志物。Serpin A1是一种与肿瘤迁移相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂。（17）。质谱分析显示，Serpin A1在转移性肝癌中的表达是原发结肠癌的2.68倍（表II）。对Serpin A1的Western blot分析也显示转移性肝癌样本（M /病例4和5）比原发结肠癌样本（P /病例4和5）增加了1.7或3.6倍。CA1是一种锌金属酶，可以催化二氧化碳的可逆水合作用（18）。质谱分析显示CA1在转移性肝癌样本中增加了1.52倍（表II）。CA1的免疫印迹显示，与这些病例中的原发结肠癌相比，转移性肝癌4例和转移性肝癌5例的水平分别提高了1.1倍和7.5倍。

选择的肝转移降低因

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