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附录A 译文

用于预测食管鳞状细胞癌预后的铁死亡相关基因模型和列线图的开发和验证

摘 要

食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种常见的恶性肿瘤，死亡率高，预后差。铁死亡是一种新发现的细胞死亡形式，由铁催化的多不饱和脂肪酸（PUFA）过度过氧化引起。然而，铁死亡相关基因（FRG）对ESCC的预后价值仍不清楚。基于来自基因表达综合数据库（GEO）的ESCC数据集，本研究通过单因素Cox回归分析确定了39个具有预后价值的FRG。经过LASSO回归和多因素Cox回归分析，构建了基于10个具有预后价值的FRG的多基因模型，并成功地将ESCC患者分为两个风险组。低风险组患者的预后明显优于高风险组患者。此外，本研究将风险评分与临床预测因子结合起来构建ESCC的列线图。列线图的预测能力通过训练和验证集中的ROC曲线和校准图进一步验证。并且列线图的预测能力被证明是优于单独的风险评分或临床因素。此外，功能分析表明，10-FRG模型主要与铁死亡、分化和免疫反应有关。连通图分析确定了能够靶向ESCC中FRG的潜在化合物。最后，本研究使用临床样本证明了SRC基因在ESCC中的预后价值，并通过体外实验发现发现SRC抑制使ESCC细胞对铁死亡诱导剂敏感。总之，本研究确定并验证了10-FRG预后模型和列线图，它们能够提供个性化的预后预测，并促进ESCC潜在治疗靶点的研究。

关键词 预后；免疫；列线图；食管鳞状细胞癌；SRC基因

1. 介绍

食管癌是全球第七大常见癌症，癌症死亡率排名第六。有两种主要的组织学亚型，食管腺癌（EAC）和食管鳞状细胞癌（ESCC），它们具有完全不同的病因、地理模式和生物学特征（Bray et al., 2018）。尽管西方国家EAC的发病率迅速增加，但ESCC仍然是东亚食管癌的主要组织学类型，每年占所有新发食管癌病例的90%以上（Bray et al., 2018）。ESCC的5年总生存率（OS）较差且复发和转移的发生率较高（Pennathur et al., 2013）。尽管用肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期系统作为预测癌症患者OS的标准方法，但相同TNM分期患者的生存率仍存在差异（Bray et al., 2018）。因此，基于TNM分期系统的ESCC预后预测需要进一步完善（Rice et al., 2017）。近几十年来，由于微阵列和RNA测序等高通量技术的进步，基因表达谱已成为被广泛用于发现与癌症表型或预后相关的分子生物标志物（Zhan et al., 2016）。最近，多基因模型，如用于乳腺癌的OncotypeDX芯片或用于结肠癌的ColoPrint芯片，已被证明对癌症具有重要的预后价值，并且所描述的模型可用于指导癌症的预后评估、治疗和管理（Birnbaum et al., 2017）。目前已经报道了许多关于ESCC基因表达谱的研究，但迄今为止还没有将基因模型应用于该疾病的生存预测。因此，迫切需要确定与ESCC预后相关的关键分子生物标志物。

铁死亡是一种铁催化的细胞死亡形式，它通过多不饱和脂肪酸（PUFA）的过度过氧化而发生（Dixon et al., 2012）。近年来，已经鉴定出几种小分子和FDA批准的临床药物可诱导癌细胞中的铁死亡（Hassannia et al., 2019）。各种研究中发现铁死亡诱导剂具有抑制癌症的功效，因此研究细胞的铁死亡具有作为一种新型抗癌策略的潜力（Hassannia et al., 2019）。之前的一项研究报告称，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的关键负调节因子，而血红素加氧酶-1（HMOX1）的下调则是通过增加不稳定铁池（LIP）促进铁死亡的不良预后因素（Shishido et al., 2020）。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）通过调节ESCC中的GPX4和HMOX1来诱导铁死亡（Shishido et al., 2020）。最近，一些研究揭示了铁死亡相关基因（FRG）模型在各种癌症中的预测价值（Liang et al., 2020; Luo and Ma, 2021; Zheng et al., 2021）。然而，这些FRG是否与ESCC患者的预后相关仍然未知。

在这项研究中，本研究从基因表达综合（GEO）数据库中收集了ESCC患者的mRNA表达谱和临床信息。然后，构建了基于FRGs的预后风险模型来预测ESCC患者的预后。此外，本研究还开发了一个结合风险评分和临床特征的列线图模型来评估预后。并且在另一个独立数据集中，验证风险模型和列线图的预后价值。然后，通过基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）来用于揭示ESCC中与此模型相关的潜在生物学特征和信号通路。之后，通过CIBERSORT和ImmuCellAI分析了在不同临床亚群的免疫细胞浸润的差异。最后，通过一系列实验，验证了FRGs在ESCC中的预后价值和铁死亡作用。概述工作流程如图1所示。

图1. 构建预后FRG模型的流程图

2. 材料和方法

2.1铁死亡相关基因的数据采集和收集

从基因表达综合数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE53624数据集作为训练集，该数据集包含119名ESCC患者的RNA表达谱和临床信息（Li et al., 2014）。并在包含有60个ESCC患者的独立队列GSE53622中进行验证。注释后共获得19,631条mRNA（Zhou and Bao, 2020）。从FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb/index.html）和先前发表的文献中检索了包含352个FRG的综合列表（Liu et al., 2020），并提供在补充表S1。

2.2 预后风险模型的构建和验证

进行单因素Cox回归分析以筛选潜在的具有预后价值的FRGs，当plt;0.1被认为具有统计学意义，并以此进行随后的LASSO Cox回归分析。应用LASSO Cox回归分析可以最小化过度拟合的潜在风险，并选择最佳的预后基因。利用十次交叉验证来确定最佳惩罚参数lambda（lambda;）。最后，本研究对这些基因进行了多因素Cox回归以获得预后模型。使用多因素Cox回归模型中的回归系数（beta;）和基因表达水平的线性组合来确定预后风险评分。式中，风险评分=（beta;1*基因X1的表达） （beta;2*基因X2的表达） （beta;i*基因Xi的表达）。根据风险评分中位数将患者分为低风险组和高风险组。两组之间的OS差异通过Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验进行比较。此外，使用R中的“survivalROC”包，绘制受试者工作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC）值，来评估基因模型的预测能力。同时，对验证队列采用了同样的分析方法，以进一步评估基因模型的预后能力。

2.3 列线图构建和评估

使用单因素和多因素Cox回归分析来确定独立的预后因素，如年龄、性别、饮酒、阶段和风险评分。随后，基于多因素Cox回归分析的结果构建列线图以预测ESCC患者的1年、3年和5年OS。然后使用“foreign”包通过校准曲线评估列线图的预测能力。此外，ROC曲线和相应的AUC值是使用“survivalROC”包生成的。采用决策曲线分析（DCA）以评估列线图与单个独立预后预测因子相比所能获得的临床益处。然后，对验证集GSE53622进行相同的操作，以评估列线图的预测能力。

2.4 交互网络和功能富集分析

在STRING网站（http://string-db.org）上进行了预后FRG的交互网络分析。使用R中的“limma”包确定低风险和高风险组之间具有错误发现率（FDR）lt;0.05和|log倍数变化（FC）|gt;1的差异表达基因（DEG）。然后，使用“clusterProfiler”包进行基于DEG的GO和KEGG分析。此外，通过GSEA分析来识别在低风险和高风险人群中丰富的生物过程、分子功能和信号通路。从分子特征数据库（MSigDB）下载KEGG基因集和GO基因集。具有以下标准的途径被认为是显着富集的：nominal（NOM）p-valuelt;0.05和FDRq值lt;0.25。

2.5 风险评分与免疫浸润之间的相关性

为探究高风险组和低风险组的浸润免疫细胞丰度，采用CIBERSORT算法对样本中各免疫细胞的浸润丰度进行评分，以评估各样本中22种免疫细胞的比例。然后，本研究比较了低风险和高风险亚组之间22种免疫细胞的浸润水平。此外，ImmuCellAI还用于估计免疫细胞浸润的丰度，并预测每个样本对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应（Miao et al., 2020）。

2.6 候选小分子的鉴定

ConnectivityMap（CMap）数据库（http://www.broadinstitute.org）能够用于预测可能抑制或诱导由特定标记编码的生物状态的潜在化合物（Lamb et al., 2006）。为了探索CMap数据库中小分子在不同亚组中的潜在活性，本研究将预后铁死亡相关基因上传到CMap数据库进行作用模式（MoA）分析。

2.7 患者和组织样本

从2004年至2008年中国梅州市人民医院的96名患者中收集了经临床和病理学诊断的ESCC石蜡包埋样本。所有患者在手术前均未接受放疗或化疗，且均未出现其他器官多发性癌症。所有患者均事先知情并同意，且本研究获得梅州市人民医院研究伦理委员会批准。从病历中收集以下临床病理参数：年龄、性别、组织学分级、浸润深度和临床分期。组织病理学诊断基于世界卫生组织标准。肿瘤分期根据国际抗癌联盟第6版肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分类确定。

此外，2019年至2021年期间，在中山大学第一附属医院的ESCC患者中获得了20个ESCC组织及其配对的相邻非癌性食管上皮组织。患者在手术前均没有接受过放疗或化疗，也没有出现其他器官的多发性癌症。手术切除后，新鲜组织立即在液氮中速冻并储存在-80°C直至总RNA提取和分析。

2.8 细胞培养和试剂

ESCC细胞系ECA9706和KYSE150购自上海细胞生物学研究所（中国上海），并在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640中培养。将细胞维持在37℃的含有5％CO₂的气氛中。咪唑酮依拉汀（IKE,#S8877）、liproxstatin-1（Lip-1,#S7699）、KX2-391（Tirbanibulin,#S2700）和塞来昔布（#S1261）购自SelleckChemicals（美国）。BODIPY-C11（581/591）（#D3861）从Invitrogen（美国）获得。

2.9 总RNA提取和qRT-PCR验证

根据制造商的方案，使用TRIzol（Invitrogen,UnitedStates）提取总RNA。使用PrimeScriptRTReagent试剂盒（TaKaRa，日本）生成cDNA。使用实时荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa，日本）在CFX96实时荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad，美国）中进行实时荧光定量PCR。使用的引物序列如下：SRC，（正向）5-GGCTCCAGATTGTCAACA-3和（反向）5-GCTTGCGGATCTTGTAGT-3GAPDH，（正向）5-ATCAATGGAAATCCCATCACCA-3和（反向）5-GACTCCACGACGTACTCAGCG-3。使用2^{-Delta;Delta;Ct}方法将相对mRNA值标准化为GAPDH基因的表达量。

2.10 免疫组织化学染色和评分

将ESCC和正常食管组织的石蜡包埋标本切成5mu;m厚的切片，并置于病理切片上进行免疫组化染色。将组织切片在柠檬酸盐缓冲溶液（pH=6.0）中于100°C加热10分钟，以促进抗原修复。然后，将切片与抗SRC的兔抗体（1:400，CST，美国）在4°C下孵育过夜，然后与二抗（DakoREALEnVision，美国）一起孵育。使用二氨基联苯胺观察免疫反应细胞，并用苏木精复染细胞核。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。切片由两名不了解临床病理学特征的病理学家在显微镜下进行独立评估。

SRC表达水平通过整合阳性肿瘤细胞的百分比和阳性染色的强度来确定。染色强度的评分如下：阴性（0分）、弱（1分）、中等（2分）和强（3分）。根据视野中阳性染色肿瘤细胞的百分比对染色程度进行评分：lt;5%（

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