水稻NAC转录因子ONAC066是干旱和氧化应激反应的积极调节因子外文翻译资料

水稻NAC转录因子ONAC066是干旱和氧化应激反应的积极调节因子

摘要：

背景：NAC（NAM、ATAF和CUC）转录因子在水稻中构成一个拥有150多个成员的大家族， 该家族中的几个成员已被证明在水稻非生物胁迫反应中起着关键作用。在本研究中，我们报道了一个新的胁迫响应NAC基因ONAC066在水稻干旱和氧化胁迫中的功能。

结果：在烟草中瞬时表达时，ONAC066定位于细胞核内，是一种转录激活剂，具有与NAC识别序列（NACRS）和AtJUB1结合位点（JBS）结合的能力。PEG、NaCl、H₂O₂和脱落酸（ABA）显著诱导ONAC066的表达。在野生型水稻中过表达ONAC066可提高干旱和氧化胁迫耐受性，增加ABA敏感性，同时降低水分流失率，增加脯氨酸和可溶性糖含量，干旱胁迫条件下活性氧（ROS）积累减少，胁迫相关基因表达上调。相比之下，RNAi介导的对ONAC066的抑制减弱了干旱和氧化胁迫耐受性，降低了ABA敏感性，同时增加了水分流失率，降低了脯氨酸和可溶性糖的含量，增加了ROS的积累，并降低了干旱胁迫条件下应激相关基因的表达。此外，酵母单杂交和染色质免疫沉淀PCR分析显示，ONAC066直接与OsDREB2A启动子中的JBS样顺式元件结合，并激活OsDREB2A的转录。

结论：ONAC066是一种核定位转录激活因子，可对多种非生物胁迫因子作出反应。利用过表达和RNAi介导的抑制转基因株系进行的功能分析表明，ONAC066是水稻干旱和氧化胁迫耐受性的积极调节因子。

关键词：耐旱性、NAC转录因子、ONAC066、氧化胁迫耐受性、水稻（Oryza sativa L.）

背景

植物在其生命周期中经常遭受多种环境胁迫，包括干旱、盐和极端温度，因此它们在分子。生化、生理、代谢和发育水平升进化出了令人深刻的机制以应对各种环境胁迫[1-3]. 在分子水平上，一个复杂的信号网络在感知到外部压力信号时被有效而及时地启动，并且这个网络最终重新编程了一个大分子的表达。通过不同类型的转录因子（TFs）在时间和空间上的协同作用产生的一组应激反应基因[1,3–5]。在过去十年中，TF家族中的许多成员，例如NAC（NAM、AFAT和CUC）、AP2/ERF、MYB、WRKY、bZIP、同源结构域、bHLH、NF-Y和CAMTA，已通过敲除/敲除和/或过表达方法进行了表征，并证明在植物非生物胁迫反应中发挥了重要作用[6–12]。

在迄今发现的与胁迫相关的TF中，植物特异性NAC蛋白的特征是在端部存在高度保守的NAC结构域，决定DNA结合活性，并在C端存在负责转录活性的可变结构域[13]。NAC识别序列（NACR）包含来自各种下游基因启动子的CATGT和CACG元件，被确定为NAC TFs的核心DNA结合位点[14]。NAC TFs是一个拥有151名成员的大家庭[15-17]。最近广泛的功能研究表明，NAC-TFs在调节模式植物和作物的生物和非生物胁迫反应中起着重要作用[8,12,18,19]。转录谱分析显示，在各种非生物和生物胁迫下，水稻ONAC家族的大部分在水稻中表现出重叠的表达模式[20,21]。功能研究已经确定了至少9个在非生物胁迫耐受性中起重要作用的水稻ONAC基因，这些非生物胁迫相关基因包括ONAC002（SANC1/OsNAC9）、ONAC048（SNAC2/OsNAC6）、ONAC009（OsNAC5）、ONAC122（OsNAC10）、ONAC045、ONAC058（OsNAP）、ONAC022、ONAC095和ONAC003（SNAC3）[22–34]。研究发现，SNAC1、SNAC2或ONAC022的过度表达显著增强了转基因水稻植株对脱水、低温和盐胁迫的耐受性[22,23]，而过度表达根特异性OsNAC5、OsNAC6、OsNAC9和OsNaC10的转基因水稻植株表现出显著的抗旱性提高[26,27,29,35]。研究发现，ONAC095在干旱和冷胁迫耐受性方面具有双重功能[34]。ONAC095对干旱反应起负调节作用，而对水稻的冷反应起正调节作用[34]。在大多数情况下，脱落酸（ABA）介导的信号通路[22,23,25,29-31]，气孔运动和根系[22,25,27-29,33]被发现参与了NAC介导的转基因植物非生物胁迫耐受性的改善。然而，SNAC3是已报道的与氧化应激相关的NAC-TFs之一，通过ABA非依赖途径发挥干旱、高温和氧化应激反应的积极调节作用[32]。此外，在严重胁迫条件下，过度表达一些与胁迫相关的NAC-TFs的转基因水稻株系表现出显著的非生物胁迫耐受性改善，对产量没有任何不利影响，甚至产量增加[22,26,27,29,30]，为这些与胁迫相关的NAC-TFs在提高作物非生物胁迫耐受性方面的应用提供了一个有希望的潜力[36,37]。

拟南芥NAC蛋白JUNGBRUNNEN1（AtJUB1/ANAC042）被发现是生长和非生物胁迫反应的中央调节器[38–40]。AtJUB1通过直接抑制编码赤霉素和油菜素类固醇生物合成关键酶的GA3ox1和DWF4基因的表达，并通过激活DELLA基因（如GA不敏感和RGA样1）的表达来调节植物生长[41,42]。在拟南芥中过度表达AtJUB1或在香蕉中过度表达MusaNAC042（AtJUB1的香蕉同源物）可增强对各种非生物胁迫的耐受性，包括干旱胁迫，而在拟南芥中敲除AtJUB1或番茄SlJUB1（AtJUB1的番茄同源物）的沉默导致对干旱和氧化应激的耐受性降低[38,39,43–45]。研究表明，在调节非生物胁迫反应时，拟南芥AtJUB1和番茄SlJUB1可以分别直接与AtDREB2A、SlDREB1和SlDREB2的启动子结合，这些启动子编码AP2型TFs，已知它们是非生物胁迫反应的关键调节因子[38,39]。此外，AtJUB1在HD Zip I类TF AtHB13的下游发挥作用，后者是抗旱性的积极调节者，在AtHB13和AtJUB1之间建立了一个联合干旱胁迫控制模块[43]。

我们对水稻ONAC基因在非生物和生物胁迫响应中的生物功能感兴趣，我们之前通过对公开的微阵列数据进行生物信息学分析，在水稻对生物和非生物胁迫的响应中确定了许多胁迫响应的ONAC基因[20]。在这些应激反应的ONAC基因中，ONAC022和ONAC095之前被证明在干旱、盐和冷应激反应中发挥作用[33,34]。在本研究中，我们利用过表达和RNA干扰（RNAi）介导的抑制转基因株系，探讨了水稻AtJUB1同源物ONAC066在调节应激反应中的功能。我们发现，在转基因水稻中过表达ONAC066可以提高干旱和氧化应激耐受性，而RNA干扰介导的抑制ONAC066可以减弱干旱和氧化应激耐受性。我们还发现ONAC066直接与OsDREB2A启动子中的JBS样（JBSL）顺式元件结合，从而激活OsDREB2A的转录。我们的数据表明，ONAC066是水稻干旱和氧化胁迫耐受性的积极调节因子。

结果

ONAC066是水稻中一个推测的应激反应性NAC基因。ONAC066基因（LOC_Os03g56580）包含1089bp的完整ORF，编码362个氨基酸（aa）的多肽，计算分子量为40.6kDa，pI为6.4。ONAC066蛋白在N端含有一个典型的保守NAC结构域，在51 aa和170 aa之间跨越120 aa，可进一步分为5个亚结构域（a到E）（附加文件1：图S1A）。系统发育树分析表明，ONAC066属于系统发育组IV[16]，与ONAC096、ONAC140和ANAC042/AtJUB1密切相关（附加文件1：图S1B），在氨基酸水平上分别显示47.7%、37.14%和34.81%的同一性。PlantCARE[46]的生物信息学分析表明，ONAC066基因的启动子区域（ATG上游1.5 Kb）包含几个推测的应激相关顺式元件，包括两个ABRE（参与ABA反应的ABA反应元件，[47]）、一个CGTCA基序（参与JAR反应的顺式元件，[48]），一个GCC盒（一个参与诱导、创伤和病原体反应的顺式元件[49]），两个TCA元件（一个参与SA反应的顺式元件[50,51]），两个富含TC的元件（一个参与防御和应激反应的顺式元件[52]），和两个HSE（参与热应激反应的cis元件[53]）（附加文件1：图S1C）。这些应激反应顺式元件在其启动子中的存在表明，ONAC066可能对多种非生物应激线索有反应。

ONAC066的DNA结合和反式激活活性

为了确定ONAC066的TF活性，以及ONAC066中负责TF活性的区域（如果有），我们使用Y1H分析检测了整个ONAC066的反式激活活性和一系列截短变体，包括ONAC066-N（1–170 aa）、ONAC066-C1（171–362 aa），ONAC066-C2（171-264 aa）和ONAC066-C3（265-362 aa）（图1a，左）。含有pGBKT7-ONAC066或其中一种变体的酵母转化子在SD中生长良好/minus;Trp介质（图1a，右）。而含有pGBKT7-ONAC066-N和pGBKT7ONAC066-C2的转化子未能在SD上生长/minus;在Trp His/5mM 3-AT培养基中，含有pGBKT7-ONAC066和变体pGBKT7-ONAC066-C1和pGBKT7-ONAC066C3的转化子确实生长并显示出beta;-半乳糖苷酶活性（图1a，右图）。这些结果表明，ONAC066具有反式激活活性，在cTER负上的265–362 aa区域对反式激活活性至关重要。

为了探索ONAC066的DNA结合活性，我们使用Y1H分析检测了ONAC066与NACR（一种标准NAC核心结合序列[14]）和JBS（一种新型NAC结合序列[39]）的结合能力。为此，将串联重复的3times;NACR和3times;JBS构建到pHis2载体中，并与Rec2-ONAC066共转化到酵母细胞中（图1b）。与Rec2-ONAC066和pHis2-3times;NACR或pHis2-3times;JBS共转化的酵母细胞生长正常，而与pGADT7-Rec2空载体和pHis2-3times;NACR或pHis2-3times;JBS共转化的酵母细胞在SD上未能生长/minus;Trp-Leu-His介质，带50mM或100mM 3-AT（图1c）。这些结果表明，ONAC066具有DNA结合活性，可以与NAC结合序列、NACR和JBS结合。

ONAC066的细胞核定位

ONAC066的亚细胞定位是通过在表达红色核标记RFP–H2B蛋白的烟草植株叶片中瞬时表达GFP标记的ONAC066结构来检测的[54]。在农业渗透后48小时，显微镜下观察到ONAC066:：GFP融合仅定位于细胞核，与已知的核标记RFP–H2B蛋白共定位（图1d）。相比之下，GFPalone在整个细胞中广泛分布，没有特异性定位（图1d）。这些结果表明ONAC066是一种细胞核定位蛋白。

非生物胁迫处理下ONAC066的表达模式

根据NCBI的公共微阵列数据，ONAC066在所有组织中都有表达，尤其是在叶片和种子中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)注册号为GSE6893（附加文件2：图S2）。我们通过定量实时PCR（qRT PCR）检测了ONAC066对非生物胁迫和外源ABA的反应性。在PEG6000处理的植株中，ONAC066的表达水平在处理后1小时（hpt）开始增加，并在24小时内逐渐增加，在24小时达到峰值，显示出比对照植株增加35倍（图2a）。在NaCl处理的植株中，在1和12 hpt下观察到高水平的ONAC066表达，与对照植株相比，分别增加了6.8倍和5.3倍（图2b）。在H₂O₂处理的植物中，在12和24 hpt时检测到ONAC066表达的显著诱导，导致与对照植物相比增加了4.8倍和18倍（图2c）。在ABA处理的植株中，ONAC066的表达水平仅在12 hpt时显著增加，比对照植株增加了3.6倍（图2d）。这些结果表明，ONAC066是一个非生物胁迫和ABA响应的水稻ONAC基因。

ONAC066-OE和ONAC066 RNAi转基因系的创制

为了研究ONAC066的功能，我们在粳稻品种中培育了ONAC066-OE和ONAC066 RNAi转基因水稻系。中华11（ZH11）背景（附加文件3：图S3A）。qRT PCR显示，ONAC066-OE株系OE11和OE12中的ONAC066转录水平比野生型（WT）植物中的高57.1倍和79.9倍，而ONAC066 RNAi株系Ri1和Ri21中的水平估计分别为野生型植物中水平的34%和39%（附加文件3：图S3B）。用GFP抗体检测到ONAC066-OE系OE11和OE12植株中的ONAC066GFP融合，显示约67.8kD的条带与融合的分子量相匹配（附加文件3：图S3C）。在ONAC066-OE和ONAC066RNAi植物中未观察到明显的形态、生长和发育特征缺陷。

ONAC066的过表达提高了水稻耐旱性，而ONAC066的抑制则削弱了耐旱性

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