SON 通过调节 PTBP1/PTBP2 转换和 RBFOX2 活性驱动胶质母细胞瘤中的致癌 RNA 剪接外文翻译资料

SON 通过调节 PTBP1/PTBP2 转换和 RBFOX2 活性驱动胶质母细胞瘤中的致癌 RNA 剪接

原文作者：Jung-Hyun Kim^1,2,8, Kyuho Jeong^2,8, Jianfeng Li^1,3,8, James M. Murphy², Lana Vukadin⁴, Joshua K. Stone1,Alexander Richard1, Johnny Tran1, G. Yancey Gillespie⁵, Erik K. Flemington⁶, Robert W. Sobol ^1,3,Ssang-Teak Steve Lim² amp; Eun-Young Erin Ahn^4,7

单位：1 Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, Mobile, AL, USA. 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,University of South Alabama, Mobile, AL, USA. 3Department of Pharmacology, College of Medicine, University of South Alabama, Mobile, AL, USA. 4Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA. 5Department of Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA. 6Department of Pathology, Tulane University School of Medicine, Tulane Cancer Center, New Orleans, LA, USA. 7 Orsquo;Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA. 8 These authors contributed equally: Jung-Hyun Kim, Kyuho Jeong, Jianfeng Li.

摘要：虽然 RNA 剪接的失调已被认为是癌症治疗的新兴目标，但人们对脑肿瘤中 RNA 剪接和个体剪接因子的功能意义知之甚少。这里我们将 SON 作为激活 PTBP1 介导的致癌剪接同时抑制多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 中 RBFOX2 介导的非致癌神经元剪接的主要调节因子。 SON 在 GBM 患者中过度表达，并且 SON 敲低导致从 PTBP1 转录物中去除内含子失败，导致 PTBP1 下调和抑制其下游致癌剪接。此外，SON 与 hnRNP A2B1 形成复合物并拮抗 RBFOX2，这导致 RBFOX2 靶向盒外显子的跳过，包括 PTBP2 神经元外显子。 SON 敲低在体外抑制 GBM 细胞的增殖和克隆形成，并在体内显着抑制原位异种移植物中的肿瘤生长。总的来说，我们的研究表明，SON 介导的 RNA 剪接是GBM的弱点，暗示 SON 是脑肿瘤的潜在治疗靶点。

多形性成骨细胞瘤 (GBM) 是最常见和致命的脑部恶性肿瘤。 GBM患者预后较差，诊断后中位生存期仅为1年，lt;5%的患者生存期超过5年^1-3。

大型队列分子图谱研究发现，在 GBM 患者中，特定基因组中经常存在遗传异常，例如 EGFR、CDKN2A/B、RB1、TP53、IDH1、NF1、PTEN和 PDGFRA^4,5.我们目前对GBM基础的理解很大程度上局限于这几个经常突变的基因及其相关通路，如受体酪氨酸激酶、p53 和 RB 信号通路^6,7。然而，GBM 细胞获得了广泛而复杂的基因表达变化，这些变化不能仅仅通过一些基因突变来解释，这表明可能存在其他因素导致GBM的基因表达异常。因此，迫切需要识别除基因突变之外的关键 GBM 依赖关系，以开发针对这种致命肿瘤的新治疗策略。

RNA 选择性剪接是转录后基因调控的关键机制，有助于蛋白质组的多样性^8–10。越来越多的证据表明，由于剪接位点突变或剪接因子突变导致的异常 RNA 剪接在多种类型的实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中指导致癌基因的表达^11,12。有趣的是，大脑是 RNA 结合蛋白 (RBPs) 表达水平最高的器官之一¹³，这暗示了RNA调节在大脑中的重要性。此外，神经元分化伴随着广泛的选择性剪接事件，以促进包含神经元特异性盒式外显子（神经元外显子）^14–16。在神经分化过程中，最广泛的调节是多嘧啶束结合蛋白 1 (PTBP1) 转换为其旁系同源物 PTBP2。 PTBP1 在非神经元细胞以及未分化的神经干细胞中大量表达，并与内含子结合以诱导神经元外显子跳跃。在神经元分化开始时，PTBP1 被下调，而被PTBP1抑制的PTBP2被上调，以增加神经外显子包涵体并诱导分化^17–19。 PTBP1 在 GBM 以及星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤和髓母细胞瘤中高度表达²⁰。最近的研究进一步表明，GBM 中 PTBP1 的上调促进了 PTBP1 靶 RNA 的外显子跳跃事件，导致产生促进细胞增殖和血管生成的致癌异构体²¹。除 PTBP1外，一些参与选择性核糖核酸剪接的异质核糖核蛋白(hnRNP)家族的成员也在 GBM 中上调^22,23。这些发现清晰表明，RNA 剪接程序的失调确实与 GBM 密切相关。然而，GBM中详细的分子机制和剪接调控因子之间的串扰在很大程度上是未知的。

SON是一种核斑点蛋白，同时包含DNA和rna结合域，尤其会在胚胎干细胞和造血干细胞以及白血病母细胞中表达上调^24–27。我们团队之前将 SON 确定为促进弱剪接位点剪接的辅助因子²⁸。SON 的消耗缺失会导致内含子的不完全去除和选择性剪接，许多 SON 靶向 RNA 与细胞周期（尤其是有丝分裂进程）和 DNA 修复/复制特别相关^24,28,29。我们最近还报道了 SON 基因中的杂合功能丧失突变导致人类大脑皮层畸形，这表明 SON 介导的 RNA 剪接在大脑中的基因表达中起关键作用³⁰。

在这里，我们发现SON在恶性脑肿瘤中异常上调，在 GBM（最具侵袭性的胶质瘤形式）中表达水平最高，并且 SON 上调与患者生存期短之间存在很强的相关性。我们证明 SON 通过促进从 PTBP1 转录物中去除内含子来上调 PTBP1（致癌 RBP），并通过控制可变剪接来抑制 PTBP2（促进神经元分化的 RBP）的表达。此外，我们发现 SON 在与 hnRNP A2B1 合作的选择性剪接过程中消除了 RBFOX2 介导的盒式外显子包含。我们的研究结果表明，GBM 细胞在体内的存活、克隆形成和致瘤性依赖于 SON 介导的 RNA 剪接，这暗示了 SON 抑制在 GBM 中的治疗潜力。

结果

SON 在脑肿瘤患者中上调，高 SON 表达与患者生存期短相关。我们团队和其他研究人员之前的研究证实了 SON 在促进细胞周期进程和干细胞性方面的功能以及它在大脑基因表达中的潜在意义^24,28–30。因此，我们检测了在脑肿瘤中SON的表达是否发生了改变。我们使用几种不同的引物组进行了逆转录和定量 PCR（RT-qPCR）(图1a)进行了逆转录和定量PCR(RT-qPCR)，以测量恶性脑肿瘤包括间变性星形细胞瘤间变性、间变性星形细胞瘤和GBM（补充表1）。有趣的是，与在 GBM 患者中观察到的最高水平的正常脑样本相比，脑肿瘤中的 SON 转录物显著上调(图1b)。与白血病不同，我们报道了 SON 的短亚型（SON E 和 SON B）占上调 SON 的大部分²⁷，我们发现全长 SON (SON F) 及其短亚型在脑肿瘤中同样上调。这些结果表明 SON 转录在脑肿瘤中增加，而 SON 转录本的可变剪接没有变化。

我们还使用公开可用的患者数据库（REMBRANDT；分子脑瘤形成数据存储库³¹, R2 数据库; http://r2.amc.nl, 癌蛋白³²，外显子表达阵列³³，GlioVis数据门户；http://gliovis.bioinfo.cnio.es³⁴)，分析了SON的表达并证实了我们在脑肿瘤中 SON 上调的发现(图1c和补充图1a-c)。我们还发现，SON的表达水平在GBM亚型之间没有显著差异，不同的G-CIMP(胶质瘤胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤(CpG)岛甲基化表型)状态也没有显著差异（补充图 1d）。

重要的是，从GlioVis数据门户网站获得的Kaplan-Meier生存分析表明，高水平的SON表达与脑肿瘤患者的短生存期相关。 SON 水平与患者存活率之间的负相关不仅在高级别 GBM 中发现，而且在来自多个队列（REMBRANDT、TCGA 和 CGGA 队列；通过 GlioVis 可视化；图1d和补充图2）的低级别胶质瘤中也被发现。总之，这些数据揭示了 SON 在恶性脑肿瘤中的显著上调以及 SON 过表达在疾病进展中的潜在作用。

SON 的上调与 GBM 中的 PTBP1 过表达相关，并且 SON 敲低诱导表达从 PTBP1 转换为其旁系同源物 PTBP2。为了识别 GBM 中 SON 调控的候选基因，我们在两个不同的恶性胶质瘤数据库（TCGA_GBM 和 Freije 胶质瘤数据集）中对 307 个基因进行了分类，这些基因的表达水平与 SON 表达呈正相关，但在正常脑（Harris 正常脑数据集）中没有。 然后，我们还在三项使用细胞系的独立研究中鉴定了 386 个基因在 SON 敲低后显着减少(图1e)^24,28,29。在这些候选基因中，我们发现了13个从所有分析中常见的基因。其中之一是聚嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）(图1e),它已被证明在几种类型的癌症中上调^35–39 并促进外显子跳跃，导致几种蛋白质（例如 CD44、PKM2、PBX1 和 ANXA7）的致瘤异构体的表达^{18,21,36–38,40–42}。重要的是，对来自我们的患者队列和公开数据库的原发性脑肿瘤样本的分析表明，PTBP1在脑肿瘤中大量表达，特别是在GBM中(图1f，g，和补充图3a，b)。通过免疫染色，我们还在 GBM 患者样本中观察到 SON 和 PTBP1 显著上调，其中 SOX2 （一种众所周知的 GBM 干性标记物）高表达（图1h和补充图4）。

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