通过Kaiso对DLG1进行表观遗传调控，改变有丝分裂纺锤体极性，促进肠道肿瘤的发生外文翻译资料

通过Kaiso对DLG1进行表观遗传调控，改变有丝分裂纺锤体极性，促进肠道肿瘤的发生

作者：MadeleineA.Young¹,StephanieMay¹,AngelosDamo¹,YoungSoYoon²,Man-WookHur²,WojiechSwat³,andLeeParry¹

摘要：

表观基因组的改变和极性的丧失都与癌症的发生，进展和转移有关。在Apc / min小鼠模型中先前已被证明的是表观遗传阅读器蛋白Kaiso的缺失抑制了肠道肿瘤的发生，其中极性改变起着关键作用。因此，我们研究了Kaiso缺乏，极性和肠道肿瘤被抑制之间的联系。我们使用Kaiso缺陷小鼠有条件地删除肠上皮细胞内的Apc，并证明了纺锤体极性基因Dlg1和Dlgap1的上调。为了了解Dlg1在其中的作用，我们繁育绒毛蛋白-creApc ^/min DLG1 ^{flx/ flx}Kaiso ^-/gamma;的小鼠来分析基因表达，存活率，肿瘤负荷，和纺锤体定向。分析Dlg1缺乏的肠道细胞显示有丝分裂中纺锤体（牵引,分裂）方向不正确以及细胞迁移的速率减慢。Dlg1缺失会降低Apc ^/min小鼠的存活率，从而验证了其在肠道中作为肿瘤抑制因子的作用。值得注意的是，Apc ^/minKaiso ^-/gamma;小鼠的存活率的提高显示出依赖于Dlg1表达。综上所述，这些数据表明维持肠腺中纺锤体极性需要调节Dlg1适当表达。由于Dlg1的丢失缺失会导致错误的纺锤体（牵引）定向，以及延迟肠腺细胞传递（退出）的时间。我们提议从隐窝中延迟退出会增加自发突变可以固定的窗口，从而产生“允许肿瘤的（利于肿瘤发生）”环境，而不会增加突变率。

启示：有丝分裂纺中锤体极性的丧失延迟了细胞从肠隐窝的退出，并诱发了致瘤环境。

1引言

认识到极性与表观遗传途径之间的联系在癌症发作和进展中的重要作用的最新工作（1）强调了需要我们加深对这些关系的理解。CpG二核苷酸的DNA甲基化是基本的表观遗传修饰。在基因启动子内部，甲基化导致转录沉默，并被包括直肠癌在内的多种不同癌症类型所利用，从而使抑癌基因沉默（2、3）。现在越来越多的证据表明，极性基因的异常表观遗传沉默会在多种情况下影响肿瘤发生（4–6）。从机制上讲，甲基化的CpG二核苷酸被甲基结合家族的蛋白质识别并结合，然后形成转录阻遏物复合物（7）。这些蛋白通过识别被异常甲基化的肿瘤抑制基因而疾病中起关键作用（2,3，8）。甲基结合蛋白Kaiso，POZ / BTB（广泛复合体Tramtrak，Bric a brac / pox病毒和锌指）家族的锌指转录因子蛋白，已显示在肠肿瘤发生中起关键作用。POZ / BTB蛋白是一个保守性很高的蛋白家族（9），已被证明在发育和癌症中均发挥作用（10，11）。尽管Kaiso要求两栖动物发育（11），Kaiso null小鼠是有生命的，并且在发育或繁殖上均未显示任何明显异常（12）。在癌细胞中，Kaiso似乎具有促肿瘤作用。它的缺失减轻了结肠癌中抑癌基因和DNA修复基因的抑制作用（13，14）。尽管它的核定位表明是较高级别的转移性乳腺癌和前列腺癌（15）。除了作为转录抑制因子的作用外，它还可以与delta;-Catenin（蛋白）结合并充当转录激活因子（16、17）。此外，研究表明，Kaiso过表达促进肠道炎症和肠肿瘤发生（18、19），而过表达则通过延迟肠肿瘤发生的发生而增加了Apc /min小鼠的存活率（12）。Apc /min小鼠是人家族性腺瘤性息肉病（FAP）的模型。在Apc / min小鼠和FAP患者中，腺瘤的形成都需要野生型Apc等位基因突变（或“第二击”）（20）。在超过80％的所有散发性直肠癌的发生中，APC突变和随后的经典Wnt途径激活是早期（即使不是第一步）的步骤（21、22）。由于其在人类大肠癌中调节肿瘤抑制基因的表观遗传沉默（13）以及在该疾病中观察到的突变频率较低（在72例中观察到0％；参考文献23、24），Kaiso代表了潜在的可药物治疗靶点。然而，由于体内Kaiso缺乏引起的肠肿瘤抑制机制尚待探索。由于Apc / min小鼠癌前和癌肠组织中的分裂细胞显示出纺锤体极性改变（25），因此我们研究了纺锤体极性的改变是否在Apc / minKaiso -/gamma;小鼠中察到的肠道肿瘤抑制中起作用。我们已经证明极性和抑癌基因Dlg1在没有Kaiso的情况下会被错误调节。Dlg1构成了Scribble / Lgl / Dlg极性复合物的一部分，该复合物已被证明在维持上皮完整性中起着重要作用（26）。在72例结肠直肠癌患者中，有12例（16.7％）观察到这种复合物的突变与一系列不同的上皮癌类型的进展相关（27-29）以及Dlg家族内的突变（23，24）。我们进一步证明，Dlg1的缺失会改变纺锤体的极性，延迟迁移并促进肿瘤的发生和发展在Apc / min和Apc / min Kaiso gamma; / minus;两组小鼠中。综上所述，这增加了证明表观遗传调控在维持肠内稳态和疾病中纺锤体极性方面的重要性的证据。

2材料和方法

2.1小鼠

所有动物程序均按照动物保护机构和英国内政部法规进行。在12小时的光照周期下，将小鼠保持在SPF隔离设施中的传统敞口式笼子中，放在Eco-Pure Chips 6 Premium床上用品（Datesand）上，并提供IPS 5008饮食（Labdiet-IPS Ltd.）提供营养支持。为了丰富环境，我们提供了经辐照的葵花籽（仅在断奶时），Techniplast鼠笼（Techniplast）和小咀嚼棒（Labdiet-IPS Ltd.）。所有小鼠均来自混合背景，并且相对于C57Bl / 6 Pla2g2a（也称为Mom-1）等位基因是纯合的。实验动物为10至15周大，兄弟姐妹为对照组。Ah-cre (30), Apcflx (31), Apc /min (32), Villin-Cre (33), Dlg1flx (34), Kaisogamma;/- (12)均已被描述过。可根据要求提供基因分型条件。通过在24小时内以80 mg / kg腹膜内注射3次beta;-萘黄酮（BNF; Sigma）进行Ah-cre转基因的诱导。对于BrdU标记，向小鼠腹膜内注射0.15 mL BrdU。以下CRE诱导loxP序列侧翼的等位基因被称为在[肠上皮细胞删除]（Delta;IEC）。

2.2芯片表达和分析

将十周大的雄性小鼠用于阵列分析。每种所需基因型的小鼠使用3只。将距离胃5 cm的小肠的三厘米部分放入RNAlater中（除去肠系膜并确保没有淋巴集结）。然后将组织均匀分布在Trizol试剂中，并使用标准苯酚-氯仿方法提取RNA。样品被送往曼彻斯特大学英国癌症研究中心分子生物学核心设施。得到生物素化的靶标cRNA并与Affymetrix Mouse430A_2基因表达芯片杂交。这些微阵列的原始数据可在http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/获得。使用AffylmGUI软件包对数据进行标准化和分析，以建立差异表达数据表，以进行微阵列数据的线性建模（35）。

2.3组织分离，报告可视化，IHC

在指定的时间点对小鼠实施安乐死，取出小肠（SI）并用水冲洗。如下解剖肠：固定近端7厘米，在10％福尔马林中固定过夜，并用石蜡包裹住。打开以下3 cm的孔，然后放入入RNA（Sigma）中，确保除去所有的肠系膜和淋巴集结。接下来的5 cm长度被分成1cm的长度，使用手术胶带捆扎，然后在4°C的4％甲醛中固定不超过24小时，然后通过常规方法加工成蜡块。将切片切成5mu;m的厚度，脱蜡，然后重新水化成PBS。使Envision 鼠或Rabbit Kit（Dako；; Agilent Ltd.），根据制造商的说明进行染色。识别丢失Dlg1的细胞我们使用经过验证的兔抗Dlg1多克隆抗体（目录号＃STJ111281；St JohnsAntibodies）以1：200进行了染色。使用抗BrdU抗体偶联物以1:50鉴定掺入BRDU的细胞，使用抗gamma;H2AX鉴定DNA损伤标记gamma;H2AX阳性的细胞（Upstate 05636）对至少三只小鼠的gt; 25个完整隐窝进行细胞分析每个基因型。

2.4细胞分析

对来自每种基因型的至少三只小鼠的大于 25个完整隐窝进行细胞分析。如前所述，从苏木精和伊红（H＆E）染色的切片中记录凋亡和有丝分裂指数（36）。隐窝底部与绒毛连接处之间的细胞被称为增生区。为了进行迁移分析，先在，2或24小时内对60至80天大的小鼠进行腹膜内注射BrdU，然后进行淘汰和解剖。在福尔马林固定的小肠卷上进行IHC分析得知BrdU掺入情况，并在每只小鼠50个半隐窝（至少四只小鼠）上测量BrdU阳性细胞的数量及其位置（隐窝底

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