酶和微生物技术外文翻译资料

EnzymeandMicrobialTechnology140(2020)109626

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Enzyme and Microbial Technology

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Highly active enzymes produced by directed evolution with stability-based selection

Ryo Kurahashi, Shun-ichi Tanaka, Kazufumi Takano*

Department of Biomolecular Chemistry, Kyoto Prefectural University, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8522, Japan

A R T I C L E I N F O

Keywords: Esterase Sulfolobus tokodaii Fitness landscape Sequence space

A B S T R A C T

In a directed evolution aimed at improving enzymatic activity, a situation occurs where highly active variants can no longer be obtained from a template protein because the template is already located at a peak (local maximum) in the fitness landscape of activity for the sequence space. To overcome this situation, the template needs to descend the mountain (lose activity) once and climb another higher mountain. However, there is no solid guideline of how the template should go down. Here, we propose a stability index. Previous studies have shown that protein evolution is potentially governed by stability, and that proteins with low activity but high stability are more favorable templates for producing highly active variants. In our earlier works on conventional directed evolution by random mutagenesis of an esterase from Sulfolobus tokodaii, we identified variants with 3- fold higher activity than the wild-type as the highest activity variants. In this work, as a first step, stability- keeping variants were selected by five rounds of random mutagenesis and screening based on halo formation assay using the substrate tributyrin at 70 °C after heat treatment for 30 min at 90 °C. These variants are likely to be scattered at the feet of various mountains in the fitness landscape. Next, these variants were pooled and used as parental proteins for a conventional experiment with activity-based selection, where the activity of variants was assayed using their cell-free extracts on the substrate p-nitrophenyl butyrate at 75 °C. After two rounds of random mutagenesis, we successfully obtained a variant with 9-fold higher activity than the wild-type. These results indicate that the two-step selection by stability and activity enables us more easily to produce markedly activity-improving variants.

1. Introduction

For artificial modification of a protein in industry, directed evolu- tion engineering is very effective [1–4]. Although various techniques for directed evolution have been developed to date, the basic techni- ques are (i) the production of a gene library in which a target gene is modified, (ii) the screening and selection of better ones, and (iii) the repetition using them [5–7]. Through these operations, the desired function is sequentially enhanced. This evolutionary process can be shown in sequence space and the fitness landscape (Fig. 1a) [8–12]. The protein sequence of interest climbs a mountain and reaches at the top while choosing the best (Fig. 1b). If a mountain that is currently being climbed is the highest in the fitness landscape, it will lead to the ac- quisition of the best variant [13]. However, if the template is on a low mountain, it needs to go down that mountain once or move sideways to find a higher mountain to climb (Fig. 1c). Of course, to climb the highest mountain, it needs to search for the highest mountain at the foot of mountains (Fig. 1d). At present, there has never been an lsquo;indexrsquo;

to tell the template to go down a mountain, move sideways or explore at the foot of mountains.

We have previously investigated the relationship between the evo- lutionary process of enzyme activity enhancement and protein stability. The results revealed that protein stability potentially governs its mo- lecular evolution and determines its direction, and that the evolu- tionary process involves an activity and stability trade-off [14–16]. Especially, variants with stability loss are immediately weeded out, but if they maintain stability to some extent, they have the ability to re- evolve. When depicted in the fitness landscape based on activity, the stability-maintaining variants exist somewhere in the mountain, but the stability-loss variants cannot exist. That is, if stability is retained, it is possible to go down the mountain (lose activity) and search at the foot of mountains (drift in the sequence space), and lsquo;stabilityrsquo; can be an index of these actions. Here, we propose a two-step directed evolution, where selection experiments using stability as an index are performed first, then selection experiments using a conventional target index (e.g., activity) are advanced (Fig. 1e). In particular, for stability-based

⁎ Corresponding author.

E-mail address: takano@kpu.ac.jp (K. Takano).

https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109626

Availableonline15June2020

Received 9 April 2020; Received in revised form 12 June 2020; Accepted 12 June 2020

0141-0229/copy;2020ElsevierInc.Allrightsreserved.

Fig. 1. Fitness landscapes. (a) Typical fitness landscape. The x and y axes represent sequence space and fitness. (b-e) The fitness is the en- zymatic activity. (b) The template protein (black circle) climbs the mountain (arrows) and reaches at the top while choosing the best.

(c) If the

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酶和微生物技术

Ryo Kurahashi,Shun-ichi Tanaka,Kazufumi Takano

摘要

在改善酶活性的定向进化中，会发生这样一种情况，即不再以从模板蛋白中获得高度活性的变异，因为模板已经位于序列空间活动的适应度景观的峰值（局部最大值）。为了克服这种情况，模板需要失去活动，再达到更高的活性。但是，对于模板应该如何下降，并没有可靠的指导原则。在此，我们提出了一个稳定性指数。先前的研究表明，蛋白质的进化可能受到稳定性的控制，而低活性但高稳定性的蛋白质是产生高活性变异体的更有利的模板。在我们早期的研究中，通过随机突变的传统定向进化，我们确定了活性高于野生型3倍的变异是最高的活性变异。在这项工作中，作为第一步，在90 °C热处理30 min后，通过70 °C的光晕形成分析和筛选选择稳定变体。这些变体很可能分散在序列空间的最低处。接下来，这些变异体被汇集，作为亲本蛋白用于传统的活性选择实验，用75 °C的底物对硝基苯基丁酸上的无细胞提取物测定变异体的活性。经过两轮随机突变，我们成功地获得了一种活性比野生型高9倍的变异。这些结果表明，通过稳定性和活动进行的两步选择使我们更容易产生显著改善活性的变异。

关键词：硫磺酸酯;健身景观;序列空间

1.项目简介

对于工业中蛋白质的人工修饰，定向进化工程是非常有效的。尽管迄今为止发展了各种定向进化技术^[1-4].，但基本技术是产生修改靶基因的基因库，筛选，选择更好的基因，以及使用它们的重复^[5-7]。通过这些操作，所需的函数被顺序增强。这种进化过程可以在序列空间和适应度景观中显示出来^[8-12]。感兴趣的蛋白质序列如爬上一座山，在选择最好的同时到达顶部。如果目前正在攀登的一座山是健身景观中最高的山，它将导致获得最佳的变体^[13]。然而，如果模板是在一座低矮的山上，它需要去下山的那座山一次，或者向侧面移动，以找到一座更高的山来攀登。当然，要爬上最高的山，它需要寻找山脚下的最高峰。目前，从来没有一个“指数”告诉模板下山，侧向移动或在山脚下探索。我们之前已经研究了酶活性增强的进化过程与蛋白质稳定性之间的关系。结果表明，蛋白质的稳定性潜在地支配着其分子进化并决定了其方向，进化过程涉及到活动和稳定性的权衡^[14-16]。特别是，具有稳定性损失的变异体会立即被淘汰，但如果它们在一定程度上保持稳定性，它们就有能力重新进化。当在基于活动的适应度景观中描述时，稳定性保持变异存在于山的某个地方，但稳定性损失变异不可能存在。也就是说，如果保持稳定性，就可以下山（失去活动）并在山脚下搜索（在序列空间中漂移），而“稳定性”可以是这些动作的指标。在这里，我们提出了一个两步定向进化，首先进行使用稳定性作为指标的选择实验，然后进行使用传统目标指标（如活动）的选择实验。特别是，对于基于稳定性的情况选择，而不是在每一轮中只选择最好的变体，而是选择一些变体，并将组合在下一轮或基于活动的选择实验中使用。

在本研究中，应用了一种来自磺脲的酯酶(Sto-Est)的酯酶来提高其活性^[17]。利用随机突变实验^[14,16,18]研究了该蛋白进行定向进化。不幸的是，随着随机突变从野生型(WT)蛋白开始，具有WT活性三倍以上的变异从未获得；经过几次随机突变后，不再获得高活性变异，其活性水平下降。这一次，通过引入一个具有多种变量选择的稳定性指数，可以很容易地获得具有更高活性的变量。基于稳定选择的两步定向进化简单而有效，有望成为蛋白质工程的一种新技术。

如图中示。1.ᾏ健身景观。(a)典型的健身景观。x轴和y轴表示序列空间和适应度。（b-e）适合度是酶的活性。(b)模板蛋白（黑色圆）上山（箭头），同时选择最好的。(c)如果模板蛋白（黑圆）位于高山，需要下山一次（虚箭头）或横向移动（虚箭头），然后爬上更高的山（箭头）。(d)攀登最高峰，需要寻找山脚下的最高峰（点箭）和攀登（箭）。(e)本文提出的两步定向演化，首先使用稳定性作为指标进行选择实验（虚箭头），然后使用传统活动指标（箭头）进行选择实验。(f)健身是相对于WT的活动。模板蛋白为WT（黑圆）。路线A：传统进化实验的结果。大约涂了三次。路线B：试验试验结果。路线C：本文的主要实验结果。

2.1.随机致突变的发生

一个包括Sto-Est基因在内的质粒，被指定为pET28a/Sto-Est，如先前报道的^[14]那样被构建。pET28a/STo-Est质粒被易出错的PCR和rTaq聚合酶和0.3 m MMnCl作为随机突变的第一个模板2，如前文一样描述。随机性的发生突变的基因被放大的由易出错的情况是已结扎的至的对应的站点的pUC19号。的结扎质粒被引入大肠杆菌JM109能力细胞。来自第二个是圆形随机的突变变该pUC19使用了质粒，包括Sto-Est变异基因。序列分析被委托

给FASMAC或欧洲鳍基因组学。

2.2.光环活性试验和稳定性检查

大肠杆菌JM109细胞在37°C下在50 mu;g/mL的LB板上转化并生长过夜。菌落用1mM IPTG和2%的凝胶转移到LB板上，并允许生长在37 °C过夜。然后在凝胶胶板上覆盖2%凝胶，1%丁丁酯作为基物，1 裂解E。大肠杆菌细胞，然后在70 °C^[19]下孵化。选择三丁酸酯作为酯酶活性测定的一般和方便的底物。通过在菌落周围形成晕检测到菊酯的水解。为了对Sto-Est变异的稳定性评估，在覆盖表达蛋白的大肠杆菌菌落生长在37 °C的盖胶板上之前，在90 °C处孵育30 min.然后，在70 °C下进行光晕活性试验7小时.如果变体的稳定性显著降低，则通过热处理完全灭活，在70 ℃时不显示晕形成。因此，在基于稳定性的选择实验中，只选择在稳定性检查中显示晕形成的变量作为稳定性保持变量。在改善活性变量的选择实验中，晕活性分析在70 °C的条件下执行5小时。

2.3.无细胞提取物及活性测定

制备无细胞变异蛋白提取物，并按先前报道的^[14]进行活性分析。简而言之，培养和离心的大肠杆菌细胞用1 mg/mL溶菌酶在37 ℃下处理30 min，然后处理37°C下60min的100%TritonX-100。将离心30 min获得的上清液作为活性测定的无细胞提取物。用1来分析每个蛋白的表达水平具有使用多个数量的BS的ImageJ标准化的%SDS-PAGEA.使用0.5 mM对硝基苯基丁酯(pNB)作为75 ℃下3 min的底物进行活性测定。在我们之前的研究中，PNB被用作Sto-Est^[17,18]的良好底物。加入1%SDS终止反应。使用405 nm的分光光度计测量产物量。减去无酶但含有底物的空白，以避免75 ℃时底物自溶的效果。这个实验至少进行了三次。

3.研究结果和讨论

3.1.两步定向演化的试验实验

两步方法由顺序稳定实验和活动索引实验组成。前者对于在不损失稳定性的情况下尽可能变化的变量是重要的。因此，为了有效地执行选择，在90°C对30min进行热处理后，在70°C的晕形成确认稳定性。在此，进行了一个初步的实验，以确定光晕测试和随后的基于活动的选择是否工作良好。以WT基因为模板进行随机突变后，检查热处理后的晕活性，作为试点实验的第一轮实验。因此，第一代试验实验都有带和没有晕的菌落，如图所示。2a.其中带晕，选择一个菌落，确定其基因序列，显示I161T的氨基酸取代。利用I161T的无细胞提取物，测量了其在75 °C时的活性。I161T相对WT高1.5（表1）。接下来，以I161T为模板进行了第二轮试点实验的随机突变，并研究了第二代试点实验无热处理的光晕活性。对7个形成晕的变体进行了测序，并分析了75 °C的活性。表1显示了关于WT的氨基酸序列和相对活性。测序显示有一个序列(P51L/I161T)有重叠，但随机突变效果良好。在这里，有许多变异携带P51L替代。这表明这种突变是在第二轮随机突变PCR中引入的。这些变异的相对活性是3.1到4.9倍。这些值也高于以前使用传统方法^[14,16,18]获得的最佳变体（约3.0倍）。高活跃的变异只通过两轮突变，可能是由于第一轮选择了I161T。在传统方法中，只选择具有最高活性的变体，因此有可能不导致选择这种变体（I161T）。在之前的第一轮比赛中，最活跃的变体是WT^[14,16,18]的1.5-1.8倍。I161T的活性也比WT高1.5倍，但基于热处理后的光晕的活性，它似乎也保持了更高的稳定性。已知，由于活性稳定性权衡^[16]，具有高稳定性的蛋白质容易受到高活性变异的影响。这一次，我们碰巧在第一轮选择了I161T，但可能还有其他变异体具有相同的能力来保持其稳定性。为了不错过这些变体，最好在进行下一个实验之前，把所有可能的变体放在一起。因此，从分散在健身景观中的山脚下的许多变体中，它更有可能通过基于活动的选择找到高度活动的变体。

3.2.基于稳定性的选择

由于在试点试验中获得了高活性的变异体，因此在更大的尺度上进行了双步定向演化。首先，如上所述，进行基于稳定性的选择实验。图中示。2b显示了第一轮基于稳定性的选择中的热处理后用于光晕活性分析的其中一个板。由于变引起的不稳定性，无晕的变异被认为被热处理灭活；一般来说，突变对蛋白质稳定性^[20-23]产生负面影响。然而，WT形成了一个光晕。此外，许多变体还显示出比WT更小的晕。这是由于突变的稳定性、活性和/或表达水平有所下降。这里，在这项工作中，在热处理后70 °C的晕形成被用来选择稳定维持变体。因此，未选择在70 °C处无活性的稳定性维持变量，并且所有所选的变量在70°C处具有一

定的活性。结果表明，引入了几种氨基酸取代。从第一代基于稳定性的选择中选择的稳定保持变异体的几十个基因被混合并用于第二轮基于稳定性的选择。在基于稳定性的选择实验中，最多进行了5轮测试。在这里，每一轮的稳定维持变异基因库分别保存，并在第一轮基于活动的选择实验中混合。图中示。2c-f展示了第二、第三、第四和第五轮实验的典型晕板。随着世世代代的发展，晕形成菌落的数量减少了，晕的大小也越来越小。这可能是由于多种突变导致的稳定性下降。第四轮之后，分析了第四代基于稳定性的选择中的8个序列（表1）。2到7个替换被证实，这表明每个随机突变并不总是包括替换。在第五代基于稳定的选择中，测量热处理后的75°C变量的活性（表1）。虽然这些变异体还没有被测序，但它们的活性比WT高出0.5到1.3倍。因此，由基于稳定性的选择提取的变量是活跃的，但低于以前的变量。

如图中示。2.ᾏ热处理后的70°C下的光晕活性分析。一种具有活性的变体通过唑菊酯的水解在菌落周围形成一个晕，而一种无活性的变体则没有。(a)第一轮试点试验。(b)基于稳定性的第一轮选择。编号了75°C活性的7个变异序列和分析（表1）。(c)第二、(d)第三、(e)第四和(f)第五轮稳定性选择。

3.3.基于活动的选择

在这部分中，我们描述了我们如何尝试通过传统的基于活动的选择实验获得的五个基于稳定性的选择实验来筛选高活跃的变体。虽然这些变体的活动不是零，但它们可能低于WT，预计在健身景观中无处不在。从这些变体开始，也就是说，从健身环境中的许多点，我们试图获得高度活跃的变体。在基于稳定性的选择实验的随机突变实验中，采用了第一轮基于活动选择的随机突变实验。在第一代基于活性的选择中，无热处理的晕活性测定中75 °C的活性（表1）。相关的活动

在这些变体中，它们比WT的变化体高出4倍以上。它们是高度活性的变异体，很少通过基于稳定性的选择或基于活性的选择获得，其结果与试点实验中基于稳定性的选择后基于活动的选择相似。因此，在通过稳定选择的基于活动的选择中，建议这种高活性变异可以立即筛选。随后，在第二轮基于活动的选择的随机诱变实验中，通过混合具有相对较高的晕活动的变异来进行实验。在第二代基于活性的选择中，16个变异体在75 °C形成的大晕（表1和图。3b)。这些变异体的活性比WT高出9倍。这远高于只有活动作为指数的定向进化的三倍增长，该指数已经尝试了几次^[14,16,18]。