茎尖冷冻疗法：一种根除病原体的技术，可以生产健康的种植材料，并为健康的植物遗传资源制备冷冻保存外文翻译资料

茎尖冷冻疗法：一种根除病原体的技术，可以生产健康的种植材料，并为健康的植物遗传资源制备冷冻保存。

原文作者Q.C. Wang1,2, B. Panis3, F. Engelmann4,5, M. Lambardi6 amp; J.P.T. Valkonen2 单位1西北农林科技大学西北植物遗传改良重点实验室2赫尔辛基大学应用生物学系3法国蒙彼利埃国际投资发展促进会4意大利罗马意大利佛罗伦萨国家研究委员会（CNR）6IVALSA /树木与木材研究所

摘要：根尖治疗是冷冻保存技术中一种新的根除病原菌的方法。冷冻保存是指生物样品在超低温下贮存，通常是液氮（-196℃），这种技术被认为是植物种质长期贮存的理想手段。在冷冻疗法中，植物病原体如病毒，植原体和细菌等，通过简单地将它们暴露在液氮中从根尖消除。芽尖中病毒和专性脉管系统限制了微生物分布不均匀，允许通过冷冻治疗使其受到损伤从而消除受感染的细胞，并从存活的无病原体分生细胞中再生健康芽。热疗和茎尖冷冻疗法可用于提高病毒的清除率。茎尖冷冻疗法易于实施。它可以处理大量的样本，导致无病原体再生剂频繁出现。小分生组织的切除和再生相关的困难在很大程度上被克服。迄今为止，已经使用冷冻疗法根除了香蕉（芭蕉属），柑橘属，葡萄，李属，覆盆子，马铃薯和红薯中的严重病原体。这些病原体包括九种病毒（香蕉条纹病毒，黄瓜花叶病毒，葡萄病毒A，李痘病毒，马铃薯卷叶病毒，马铃薯Y病毒，覆盆子浓密矮缩病毒，甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿特技病毒），甘薯小叶植原体和黄龙病病原菌导致了“柑橘绿化”。针对包括农业和园艺作物和观赏植物在内的各种植物物种开发了超低温保存方案，并且可以原样使用或调整用于冷冻疗法的目的。

关键词：细菌；冷冻疗法；消灭病原体；植原体；植物组织培养；病毒

保护粮食安全的植物遗传资源

今天的世界人口为66亿，预计到2050年之前将增加50％（联合国人口活动基金会，2007年），为如此迅速增长的人口提供粮食安全将需要大幅增加作物产量。显然，作物质量和数量的进一步发展面临的挑战比以往任何时候都大（霍布斯，2007年）。栽培作物及其野生亲缘植物遗传资源的可获得性是通过传统育种和生物技术技术育种精英栽培种的先决条件。确保作物质量和数量的可持续农业生产在很大程度上取决于植物遗传资源的高效保存和适当利用。据估计，多达100000种植物，即超过所有植物种类的三分之一面临灭绝（图形标准规划委员会，2007年）。工业化，城市化，特别是全球变暖将使这种情况恶化。《粮食和农业植物遗传资源国际条约》是在联合国粮食及农业组织框架内制定的，于2004年生效。其目标是保护和可持续利用粮食和农业植物遗传资源，公平和公正地分享其用于可持续农业和粮食安全的利益。

植物种质的低温保存

低温保存，即通常在液氮（-196℃）中的超低温下活细胞，组织和器官的储存被认为是用于植物种质长期储存的理想手段。细胞分裂和代谢过程在液氮的温度下停止，理论上，植物材料可以在无限期的时间内保持不变（恩格尔曼，1997年，本森，2008年）。此外，占用的存储空间很小，很大程度上避免了污染，只需要有限的维护。对于无性繁殖的植物种质的长期储存，有组织的组织如芽尖比细胞和愈伤组织培养物更优选，因为它们在遗传上更稳定。将植物引入组织培养有助于在生理和生长阶段均衡切下茎尖（英格曼，2004年）。

在冷冻保存或冷冻疗法中使用的拍摄尖端在解剖学上定义为由顶端或侧面的分生组织（1-1.5mm大小）组成的结构，具有三至四个叶原基（高田，田阪，2002年，本森，2007年）。分生组织中的细胞是紧密堆积的，没有细胞间空腔，形状很小且形状相同，并具有较大的核质体积比（埃利奥特，2003年，王，2008年）。液泡很小，分散在细胞中，原生质含有大量的细胞器，如前质体，线粒体，高尔基体和与内质网相关的核糖体（Fahn，1985）。细胞和液泡的大小增加，并且核心细胞比率随着距心尖穹顶（AD）的距离增加而减小（Helliot等人，2002,2003; Wang等人，2008）。分生细胞能够自我更新并产生分化的子细胞，从而导致植物器官的产生（Dello Ioio等，2008）。因此，细胞分裂和分化是分生组织再生所需的两个基本生理过程。

植物激素在平衡干旱维持和器官生产中发挥着核心作用（Shani等，2006; Kyozuka，2007; Dello Ioio等，2008）。细胞分裂素正调节细胞分裂。 高细胞分裂素活性维持细胞分裂，而高的赤霉素和生长素活性有利于侧生器官的启动和分化（Shani等，2006; Kyozuka，2007）。通常，应将特定浓度的细胞激肽和生长素组合提供给分生组织培养基以优化芽再生（Faccioli＆Marani，1998）。

迄今为止，低温技术已成功应用于大量的植物物种，包括来自温带和热带地区的农艺和园艺作物（Reed，2002; Lambardi＆De Carlo，2003; Engelmann，2004; Panis＆Lambardi， 2006; Wang＆Perl，2006; Gonzalez-Arnao等，2008）。在一些基因库中已应用低温保存茎尖以长期保存德国马铃薯等无性繁殖物种的遗传资源（Mix-Wagner，2003; Keller等人，2008）和国际马铃薯的秘鲁中心（CIP）（Golmirzaie＆Panta，2000），美国的梨（Reed等，2000）和比利时的香蕉（Panis＆Lambardi，2006）。为了长期储存各种营养繁殖作物，例如薄荷，木薯，甘薯，芋头和草莓，超低温保存方案也正在大规模地进行测试（Reed，2002,2008; Engelmann，2004; 冈萨雷斯 - 阿尔诺等人，2008）。

Benson（2007,2008）全面地重新审视了低温生物学和低温保存光合作用生物体及操作，风险和安全问题，这些问题在低温生物学研究转化为实践时必须予以考虑。这些问题也与植物的冷冻治疗相关。 我们在这些方面向读者提及本森的上述论文。 表1提供了与冷冻治疗有关的术语表。

表1

冷冻保存：在超低温下储存活细胞，组织和器官，通常是液氮（-196℃）

冷冻疗法：一种使用极冷的技术（例如液氮技术）根除病变组织中的微生物

分裂组织：一组未分化的细胞，能够持续细胞分裂产生芽或根

分生组织培养（或芽尖培养）：在无菌条件下在人工培养基上培养分生组织（或芽尖）

病原体：导致疾病的微生物或病毒

病原体根除：使用允许无病原体植物繁殖和生长的技术从活植物中去除病原体

植物遗传资源：植物的所有遗传物质

植物再生：由单个细胞或一组细胞形成整个植物

全身性感染：病原体繁殖并从感染的最初部位移至植物其他部位的过程

热疗：使用热量来减缓病原体的繁殖。 与分生组织/芽尖培养结合使用，根除病毒和植原体

无性繁殖：通过器官（枝或根）的体细胞再生产生新的植物个体而不产生有性繁殖的过程。新植物的基因型与母株相同。

玻璃化：水溶液转变成无定形或玻璃状固体的物理过渡过程，避免了细胞内冰晶的形成

从作物植物中消灭病原体的需求和传统方法

无病菌种植材料的供应是所有作物高产和高质量的关键。 植物病害威胁着农业生产的生产力和可持续性（Waterworth＆Hadidi，1998）。确保世界许多地区粮食安全的作物品种，如马铃薯，甘薯，烹饪香蕉和木薯都是无性繁殖的，因此特别容易由种植材料中一代一代地传播的病毒引起的损失 （Hadidi等，1998; Loebenstein等，2001; Loebenstein＆Thottapilly，2003）。许多经济上重要的园艺作物，如柑橘，梨果和石果树，浆果作物和观赏植物也存在类似的问题（Nemeth，1984; Hadidi等，1998）。

植物体是植物的专性寄生虫，直到20世纪60年代才被发现（Doi等，1967），但自那以后，它们对农业生产的经济影响已被充分证明（Hogenhout等，2008）。例如，与植原体相关的疾病 - 木瓜枯死的流行病导致昆士兰州东南部和西澳大利亚州2002年的作物损失高达100％（Streten＆Gibb，2006）。在加勒比地区，中南美洲，墨西哥和非洲地区，由植原体引起的椰子致死性泛黄破坏了整个种植园（Mpunami et al。，1999）。由细菌引起的黄龙病（HLB）疾病或“柑橘绿化”传播到受感染的种植材料中，并已经在许多亚洲国家摧毁了柑橘业，在巴西杀死了数十万棵树，并从26个弗洛拉达县 它在2005年首次报道（Callaway，2008）。它被认为是最具破坏性的柑橘病（Bove，2006; Callaway，2008）。

长期以来人们都知道病毒在植物中分布不均匀（Holmes，1948; Kassanis，1950）。植原体和专性细菌寄生虫居于植物脉管系统，仅侵入支持其运动并且分布不均匀的组织（Li等，2006; Hogenhout等，2008）。因此，在受感染的植物中，分生组织的最年轻部分（穹顶）通常是无病原体的或含有非常低浓度的病毒和植原体，而与距分生组织越来越远的距离发现相反。在用于根除病原体的分生组织培养中，因此重要的是将尽可能小的分生组织尖端切除以用于体外培养和再生以确保其病毒和植原体的自由。

分生组织由活跃分裂的细胞构成，直径为0.1毫米，平均长度为0.25毫米，取决于植物物种（Quak，1987）。然而，切除这样的小分生组是困难和耗时的，并且它们的再生常常是有问题的。因此，通常切除大约1.0mm的更大的“分生组织提示”，但是减少获得无病毒植物的机会。病毒根除的常规方法包括热处理（热疗）（Kassanis，1950），它可以在受到分生组织培养之前施用于组织培养的芽上，从而抑制病原滴度并增强病毒根除（Walkey ＆Cooper，1975）。

低温保存技术在茎尖冷冻治疗中的应用

从本质上说，茎尖超低温保存是指茎尖暴露于超低温条件下，贮存和再生增殖的过程。该过程中的关键步骤是将组织浸入液氮之前使细胞脱水（Engelmann，2004）。 另外，细胞内细胞内水的结晶使细胞受到致命的伤害，因为晶体穿透膜结构。因此，为了成功进行低温保存，必须避免致命的细胞内损伤。经典的冷冻技术（缓慢冷冻）基于冻结诱导经典的冷冻技术（慢速冷冻）基于冷冻诱导的脱水（Kartha，1985）。 “一步冷冻”冷冻技术（即允许将外植体直接浸入液氮中的技术）自1990年以来就已建立（Engelmann，1997）。现代脱水技术的基础是玻璃化，即水直接从液相转变为非晶相或玻璃（Fahy et al。，1984）。 封装 - 脱水，封装 - 玻璃化，玻璃化，液滴冷冻和液滴玻璃化是最受欢迎的新型“一步冷冻”冷冻技术（Engelmann，1997,2004; Wang＆Perl，2006; Wang＆Valkonen，2007 ; Gonzalez-Arnao等，2008; Reed，2008）。在这些基于玻璃化的过程中，在将茎尖直接浸入液氮之前，通过将裸露或封装的茎尖暴露于高度浓缩的玻璃化溶液如PVS2（植物玻璃化溶液2号; Sakai等，1990）或通过风干（Fabre＆Dereuddre，1990）。

在冷冻治疗中，利用冷冻治疗期间的细胞致死性损伤来杀死感染的组织。 位于距AD较远且更可能被病毒或植原体感染的细胞比位于AD的分生区中的细胞对损伤更敏感。因此，AD和第一叶原基中的细胞是那些可能存活并再生成无病原体芽的细胞。 因此，在冷冻疗法后再生植物的比例较传统分生组织培养所获得的可能是无病原体。

为了达到病原体根除的高效率，可能有必要调整既定的冷冻保存方案以增加细胞的死亡率。 此外，在切除芽尖前对芽进行热疗可能有助于进一步增强冷冻治疗对病原体的清除（Wang et al。，2008）。

图3

感染体外原种培养物→切除芽尖→操纵芽尖以增加它们对脱水和冷冻处理的耐受性→玻璃化脱水→液氮处理→用于存活和植物再生的后期培养→对再生植物进行病原体的索引，并进行类型评估

上图是茎尖冷冻治疗的主要步骤。封装 - 玻璃化方案的冷冻疗法特异性步骤将仅需要4天到使用常规分生组织培养完成马铃薯或甘薯根除病毒所需的2-3个月的总时间（Wang et al.2006; Wang＆Valkonen 2008b）。 操纵芽尖以增加它们对脱水和冷冻处理的耐受性需要3天。 液氮中的玻璃化和处理分别需要2小时和1小时。 存活和植物再生的后培养需要2.5个月，这与分生组织顶端培养后芽再生所需的时间没有差别。

冷冻治疗病原体根除病例研究

Brison等人 （1997）是第一个成功应用冷冻疗法来消除植物病原体。 使用玻璃化方案从种间李属砧木根除痘病毒（PPV）。此后，该技术已成功应用于根除6个家庭栽培植物的病毒，植原体或细菌（表2）。 图3总结了冷冻疗法的主要步骤。

从主食作物中消除病毒

甘薯羽毛斑驳病毒（SPFMV;马铃薯Y病毒属）以非持续方式由蚜虫传播（Loebenstein＆Thottapilly，2003），而甘薯褪绿特技病毒（SPCSV; Crinivirus属）由粉虱以半永久性 ，非循环方式（Sim等人，2000）。SPCSV限于韧皮部，而SPFMV感染甘薯植物中的所有类型的组织（Karyeija等2000; Wang＆Valkonen，2008b）。 SPFMV和SPCSV是感染甘薯最常见的病毒之一[Ipomoea batatas（L.）Lam .; 科瓦科]（Tairo等，2005; Njeru等，2008，及其中的参考文献）。它们相互作用协同作用，共同感染导致红薯病毒病（SPVD）的发展，这是红薯作物的最具破坏性的疾病，导致产量减少高达90％（Ngeve＆Bouwkamp，1991; Mi

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