研究呼出气中蛋白作为哮喘潜在生物标志物的一种新方法外文翻译资料

研究呼出气中蛋白作为哮喘潜在生物标志物的一种新方法

原文作者：K. Bloemen, R. Van Den HeuvelE. Govarts

单位: 比利时摩尔佛兰德技术研究所环境风险与健康毒理学

摘要：背景：哮喘是以气道炎症为特征的复杂的临床疾病。最近，各种研究报道了使用呼出气冷凝液（EBC）来分析寻找潜在的哮喘生物标志物。然而，对于如哮喘这样复杂的疾病，一个生物标志物可能不足以进行早期诊断或后续随访。目的：应用蛋白质组学分析可揭示疾病特异性的蛋白水解肽或蛋白质模式，并且可能可以识别出新的蛋白质来检测哮喘。方法：采用液相色谱 - 质谱联用技术分离检测30例健康儿童和40例6-12岁年龄组儿童EBC样本中蛋白质（蛋白水解肽）的含量。结果：支持向量机分析的结果是基于哮喘状态的差异。这些蛋白水解肽的模式与一些众所周知的(肺活量测定，呼出的一氧化氮)和最近描述的呼出标记(EBC pH, LTB4)没有关联。EBC中较丰富的蛋白被鉴定为细胞角蛋白、白蛋白、肌动蛋白、血红蛋白、溶菌酶、皮肤素和钙粒蛋白B。结论：虽然目前尚不清楚所呈现模式中描述的蛋白质在疾病发展或气道生理状态中的确切作用，但这是寻找用于哮喘的呼出生物标志物的重要步骤。这项研究表明，EBC含有能够对未来非侵入性哮喘诊断或随访的潜在蛋白质。

关键词：哮喘;生物标志物;呼出气冷凝物;呼出气冷凝液

简介：

哮喘是一个日益严重的全球性健康问题：它是儿童中最常见的呼吸道慢性炎症性疾病。哮喘是一种复杂的临床疾病，其特点是气道阻塞、气道高度反应的各种刺激和气道炎症，这些都在疾病的严重程度上表现各不相同，其中过敏成分经常出现。确定特定的生物标志物可以对肺部疾病进行早期诊断、监测和随访，这是呼吸内科的目标之一。目前的技术，如支气管肺泡灌洗和痰液收集是侵入性的技术，不适用于儿童。

由于一氧化氮(NO)被认为是呼出气中气道炎症的重要指标，非侵入性技术评估气道炎症的领域迅速发展。NO是被最广泛研究的呼出气体生物标志物，呼出气NO水平的增加在哮喘患者中被广泛记录。

呼出气冷凝物（EBC）是一种新兴的技术，最近被用作一种非侵入性研究工具以获得对病理生理机制的了解。由于其直接来源于呼吸道，EBC反映了特定时刻呼吸道的生理状态。美国胸科学会和欧洲呼吸学会（ATS / ERS）建立了一个EBC工作组。EBC由来自下呼吸道的冷凝气和气溶胶颗粒组成，并且包含大量的介体。本研究以EBC pH和leukotriene B4为研究对象，对哮喘进行了研究。 EBC中LTB4浓度（用LC / MS / MS测定）在哮喘患儿中升高，在哮喘儿童中的EBC的酸化已经被报道。蛋白质组学的使用可能揭示特定疾病的模式，并且可能得到用于早期疾病检测或新的治疗靶标的新蛋白质。

本研究的目的是探讨是否可以根据EBC样本的蛋白质谱对哮喘儿童和健康对照组进行区分。主要目的是区分哮喘儿童和健康对照，以及区分不同控制水平的哮喘儿童。采用蛋白质组分析方法对EBC样品进行研究，筛选出两组不同表达蛋白的总体模式。此外，也检验了该曲线与呼出的NO(嗜酸性气道炎症标志物)、EBC pH(在炎症过程中呼出的空气被酸化)和EBC白三烯B4(中性粒细胞炎症标志物)之间的相关性。

呼出气冷凝液蛋白水解肽模式

在本研究中，我们重点研究了EBC样本中的蛋白质分析，以寻找新的非侵入性的哮喘生物标志物。在EBC中鉴定一种蛋白质或一种肽段，将有助于评估气道状况。该剖面的变化可以提示潜在的炎症过程，有助于在早期发现哮喘，及早识别疾病进展，并评估其严重性，尤其是在病情恶化期间；对指导药物治疗也很有用：可以提供信号，在症状出现和肺功能损害之前开始治疗。随着蛋白质组学研究的出现，在EBC中筛选潜在的肺部炎症生物标志物已经取得了决定性的方法学进展。尽管蛋白质组学技术已经应用于EBC样品，但这些研究中没有比较哮喘患者和健康个体样品之间的肽谱。由于哮喘等气道疾病的复杂性，一个生物标志物可能不足以区分健康人群和疾病人群。应用蛋白质组学结合统计学的SVM分析，可以选择一种基于10个多肽的模式，从而可以区分部分控制、未控制的哮喘患者和健康对照组。此外，基于11个多肽质量的模型能够更接近地预测这些多肽的总体模式是否是观察到的典型模式。根据14个多肽的模型，对哮喘患者和健康对照组能进行98%的正确分类。使用模型尝试区分五个组(没有医生诊断的哮喘，控制哮喘，中度哮喘，不受控制的哮喘，和健康组)，并未得到有效的结果，很可能是因为样本量太小，需要进一步的研究。需要进一步的研究来寻找一种模式，提供关于各种疾病状态的信息，有助于疾病的随访、早期诊断、甚至在临床症状出现之前就介入治疗。为了达到这个目的，在不同的疾病状态下追踪个别患者可能是有价值的。

由于这是第一个将蛋白质组学应用于EBC样本的研究，样本数量相对较少。这是本研究的一个局限性。在相对较小的样本量中处理这些蛋白质组数据时，过度拟合常常引起质疑。因此，我们使用了SVM分析，SVM分析能使小样本的数据显示出最可靠的结果，避免了过度拟合。应用10倍交叉验证，证实了在模式中选择的少数肽能够区分疾病的存在或不存在。

在这项研究中呈现的模式与其他呼出标记物EBC pH，白三烯B4和FENO没有相关性。一旦确定了所呈现的模式中的单个蛋白质，就可以检查它们与其他标记物的相关性,将增强哮喘气道的机制知识。

尽管结果很有希望，但我们意识到，在将这项技术得到的生物标志物模式在临床实践中常规使用之前，仍然需要克服各种困难。本研究没有对单个样本进行重复的蛋白质分析，因为可用的EBC的容量不够：每次分析需要1mL EBC。另外，对新样品进行分析时发现，并不是所有包含在模型中的肽都能被再次检测到，因为包含在SVM模型中的潜在生物标志物是丰度非常低的蛋白质，其含量接近于检测技术的极限，使得结果特别容易受到实验方案中微小变化的影响。然而，包含在模型中的所有肽都是正确分类所需的，因为单个多肽的个体分类能力不是100％。因此为了提高不同系列样品之间的蛋白质回收率和再现性，需要对方案进行进一步的标准化。通过对收集装置或浓缩方案进行改进，可以获得更好的蛋白质回收率，并且将改善对目标蛋白质的检测。RTube是由聚丙烯制成的，与其他设备的表面相比，蛋白质回收效率较低。此外，更灵敏的分析或检测方法将改善潜在生物标志物的检测。

蛋白质鉴定

另一个需要改进的部分是鉴定模型中包含的蛋白质。虽然我们能够在EBC中鉴定出更丰富的蛋白质，但到目前为止我们无法确定在模式中存在的所有蛋白质都能被鉴定。潜在的生物标志物，包括那些在模型中所选择的生物标志物，它们不丰富并且难以识别。但是这些蛋白一旦得到鉴定，就可以开发出其他更敏感的技术，并且测量可以集中在这些蛋白质上。收集装置上的蛋白质回收率的提高应该能提高检测效率。更敏感的探测器也可能有助于识别更多的蛋白。

虽然所有已发表的关于EBC的蛋白质组学研究均观察到细胞角蛋白是EBC中存在最丰富的蛋白质，在EBC中测量的细胞角蛋白可能来源于气道，能为我们提供有关气道上皮损伤的信息。但关于细胞角蛋白亚型1、9和10在气道上皮细胞中的存在的信息很少。为了解决来自样品的细胞角蛋白真实性的问题，如前所述，使用模拟样品检查样品处理程序。在EBC中发现的细胞角蛋白异构体与典型的被头发，皮肤或衣服污染后存在的细胞角蛋白异构体不同。此外，在我们以前的研究中，我们观察到与不吸烟者相比，吸烟者样本中细胞角蛋白的含量更丰富。在本研究中，我们发现EBC中的这些蛋白在与健康个体中比在哮喘患者中的更为丰富。

除了在EBC中所鉴定出的丰富的细胞角蛋白以外，我们能够证实EBC中还存在一些低丰度的蛋白质，例如白蛋白，肌动蛋白，血红蛋白，溶菌酶，皮肤霉素和钙粒蛋白B。这些蛋白质已经在支气管肺泡灌洗液中被发现，但是据我们所知，另一组报道在EBC中只有白蛋白和皮离蛋白存在。血红蛋白一般存在于血液中，它在血液中起氧气运输的作用。血红蛋白在肺泡上皮细胞中的内源性合成表明血红蛋白可能在肺中具有额外的功能，例如促进穿过空气-血液屏障的氧气运输，表现为氧气传感器，同时起氧气或NO清除剂的作用，保护肺泡上皮免受氧化/亚硝化应激。白蛋白也是一种转运蛋白。肌动蛋白在细胞分裂、肌肉收缩和修复反应中起作用。溶菌酶是一种重要的气道表面液体抗菌化合物，它主要来源于气道黏膜下层的浆液细胞，也来源于表面上皮细胞。钙粒蛋白B由循环的嗜中性粒细胞、单核细胞和上皮细胞（以及其他肺）表达和分泌。钙粒蛋白B与炎症有关，但其确切的生物学作用仍有待确定。

EBC中存在的分子的来源目前还没有确定，EBC样品的唾液污染也不能排除。尽管各种研究报道表明，EBC和唾液中的生物标志物浓度彼此不相关。并且多项研究表明，EBC一般不会发生唾液污染，但有一项研究表明EBC中的分子，如LTB4来源于唾液而不是来自下气道。因此，在进一步分析之前检查所有样本的唾液污染非常重要。在该研究中，基于在光谱中存在来源于alpha;-淀粉酶的肽，从而在分析中排除了三个样品。分析的其余样品中，对应于alpha;-淀粉酶的m/z在MS谱中缺失以及在这些样品中缺乏淀粉酶的活性，证实唾液污染不存在或低于检测极限。由于alpha;-淀粉酶是唾液中的一种非常丰富的蛋白质，因此未检测到该蛋白质谱的样品的原因可能是样本仅包括源自呼吸道的可检测蛋白。呼出气中测量到的另一种蛋白质的来源被认为是来自环境空气，这在目前的研究中还没有被核实。

外文文献出处：K Bloemen. R. Van Den Heuvel. EGovarts. A new approach to study exhaled proteins as potential biomarkers forasthma.Clinical amp; Experimental Allergy, 2010(41): 346–356.

附外文文献原文(见后页)

A new approach to study exhaled proteins as potential biomarkers forasthma

K. Bloemen, R. Van Den Heuvel, E. Govarts

Summary

Background Asthma is a complex clinical disease characterized by airway inflammation.Recently, various studies reported on the analysis of exhaled breath condensate (EBC) in thesearch for potential biomarkers for asthma. However, in a complex disease such as asthma,one biomarker might not be enough for early diagnosis or follow-up.Objective The use of proteome analysis may reveal disease-specific proteolytic peptide or proteinpatterns, and may lead to the identification of novel proteins for the detection of asthma.Methods Liquid chromatography and massspectrometry were used to separate and detectproteins (proteolytic peptides) present in EBC samples from 30 healthy children and 40children with asthma in the age group of 6–12 years.Results Support vector machine analysis resulted in differentiating profiles based on asthmastatus. These proteolytic peptide patterns were not correlated to some well known (spirometry,exhaled nitric oxide) and more recently described exhaled markers (EBC pH, LTB4). The moreabundant proteins in EBC were identified as cytokeratins, albumin, actin, haemoglobin,lysozyme, dermcidin, and calgranulin B.Conclusion Although the exact role in the disease development or physiological state of theairways of the proteins described in the presented pattern is not clear at this moment, this is animportant step in the search for exhaled biomarkers for asthma. This study shows that EBCcontains proteins that are of interest for future non-invasive asthma diagnosis or follow-up. 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 11 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[281321]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word