转录因子WRKY75、水杨酸和活性氧参与的三组分循环扩增加速叶片衰老外文翻译资料

转录因子WRKY75、水杨酸和活性氧参与的三组分循环扩增加速叶片衰老

原文作者：Pengru Guo,a,b,1 Zhonghai Li,b,1 Peixin Huang,a,b Bosheng Li,a Shuang Fang,c Jinfang Chu,c and Hongwei Guoa,2

单位：

a深圳市南方科技大学生物学系植物与食品科学研究所，广东 518055，中国

b北京大学生命科学学院北京 - 清华大学生命科学联合生命科学研究所蛋白质与植物基因研究国家重点实验室，北京100871

c中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因研究中心(北京)，北京100864

叶的衰老进程是高度协调的、复杂的过程涉及许多内部和环境信号的整合。水杨酸（SA）和活性氧（ROS）是功能明确的参与叶片衰老的诱导剂，其叶片衰老过程中的含量的逐步增加具有相互依赖的特点，而具体作用机制还不清楚。本研究中，我们发现转录因子WRKY75是参与叶片衰老调控的正调节因子。敲低或敲除WRKY75的表达延迟了年龄依赖的叶片衰老，而WRKY75的过表达加速了这一过程。WRKY75转录受叶龄、SA、H2O2和多种植物激素诱导。同时，WRKY 75通过诱导SA INDUCTION-DEFICIENT2（SID2）的转录促进SA的产生，并通过抑制CATALASE 2（CAT2）的转录来抑制H2O2的清除。遗传分析表明，SID2的突变或过氧化氢酶活性的增加回补了WRKY75过表达引起的早熟叶片衰老表型。基于这些结果，我们提出了一个三组分循环扩增模型，其中WRKY75的上调表达、SA和ROS的逐步积累经历由三个彼此连接的正反馈回路驱动。这种三组分扩增环提供了一个分子框架，将上游信号如年龄和植物激素连接到由SA和H2O2响应转录因子在叶片衰老过程中发挥功能的下游调控网络。

引言

叶片衰老是自然界中观察到的一种常见的发育现象，帮助在秋季创造出令人惊叹的景色。叶片发育的最后阶段最终导致叶片死亡（Gan and Amasino, 1997; Lim et al., 2007）。在植物器官衰老过程中，衰老叶片释放的养分被循环到有活力的、正在生长的幼叶和发育中的果实、种子中(Lim et al., 2007; Zhou et al., 2009)。这个至关重要且复杂的过程受到营养缺乏等环境因素的影响，这些因素包括干旱或盐胁迫、极端温度、病原体攻击和内部因素如年龄、植物激素、活性氧（ROS）和繁殖（Gan and Amasino, 1995; Beers and McDowell, 2001; Lim et al., 2007; Woo et al., 2013）。在植物激素中，细胞分裂素和生长素延缓叶片衰老，而乙烯、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）加速叶片衰老(Lim et al.,2007; Jibran et al., 2013)。

SA对叶片自然衰老的促进作用早已被人们所认知(Buchanan-Wollaston et al., 2005; Lim et al., 2007;Rivas-San Vicente and Plasencia, 2011)。内源性SA浓度随着叶片衰老而逐渐升高，诱导叶片衰老过程中多个衰老相关基因(SAGs)的表达(Morris et al., 2000; Lim et al., 2007)。拟南芥在SA响应或生物合成途径上存在缺陷的植株，如npr1 (PR基因的非表达体)、pad4 (PHYTOALEXIN 缺陷体4)突变体和NahG转基因植株，其SAGs基因明显下调表达、凋落和衰老表型明显减少，植株衰老表型延迟 (Morris et al., 2000; Lim et al., 2007)。自噬缺陷突变体(atg3和atg5)、pat14突变体(蛋白s -酰基转移酶14)或s3h突变体(sa3 -羟化酶)均积累了大量游离SA，表现出叶片早衰表型(Yoshimoto et al., 2009; Zhao et al., 2016; Zhang et al., 2013)。另一个有趣的发现是，SA处理叶片和年龄依赖型衰老叶片的基因表达在全基因组转录组分析中表现出高度的重叠 (Lim et al., 2007)，进一步支持SA对叶片衰老的刺激作用。

大量的内源性H2O2是由多种环境胁迫产生的，如过量的光照、干旱或高盐度、极端温度以及一些关键的发育变化，也会加速叶片衰老(Apel and Hirt, 2004; Mittler et al.,2004; Khanna-Chopra, 2012)。随着叶片衰老进程，H2O2含量的升高可能导致蛋白质和脂质氧化增加和功能障碍，这是衰老综合征的一个组成部分 (Vanacker et al., 2006)。产生过量H2O2的拟南芥突变体，如cpr5 (PR GENES5的组成表达)和jub1 (JUNGBRUNNEN1)，表现出早熟的叶片衰老 (Jing et al., 2008; Wu et al., 2012)。相反，H2O2积累减少的突变体，如ntl4 (具有跨膜基序1 - like4的NAC)和aaf-KO (拟南芥a - 15敲除)，则表现出延迟干旱诱导的叶片衰老和年龄依赖性的叶片衰老 (Lee et al., 2012; Chen et al., 2012)。有趣的是，H2O2诱导SA的积累，反之亦然。例如，H2O2的外源应用通过一个未知的机制诱导烟草叶片中的SA生物合成 (Leon et al., 1995)。同时，SA直接灭活过氧化氢酶（CATs）和抗坏血酸过氧化物酶（APXs），两种类型的H2O2清除剂，从而导致H2O2积累 (Durner and Klessig, 1995, 1996; Rao et al., 1997)。

基因组学研究表明，随着叶片衰老进程，数十个转录因子(TFs)被高度上调 (Woo et al., 2016)。近年来，许多所谓的“衰老相关转录因子”在叶片衰老调控中的作用已被证实。例如，拟南芥WRKY6、WRKY22、WRKY53、WRKY54、WRKY57、WRKY70等几种WRKY TFs在叶片衰老过程中起着正调控或负调控的作用 (Robatzek and Somssich, 2001; Miao et al., 2004; Miao and Zentgraf, 2007; Zentgraf et al., 2010; Zhou et al., 2011; Besseau et al., 2012; Jiang et al., 2014)。我们之前建立了叶片衰老数据库，其中从44个物种中收集了5357个SAG和324个衰老相关的突变体 (Liu et al., 2011;Li et al., 2014)。通过数据挖掘结合表型筛选，WRKY75被认为是另一种正向调节叶片衰老的“衰老相关转录因子” (Li et al., 2012)。本研究探讨了WRKY75调控拟南芥叶片衰老的分子机制。我们发现，一方面SA和H2O2增加了WRKY75的表达。另一方面，WRKY75通过诱导SA缺陷2 (SID2)转录和通过抑制CAT2转录抑制ROS清除来增加SA的产生。遗传学研究表明，wrky75诱导的SA生物合成和H2O2积累对加速叶片衰老进程具有重要作用。因此，我们的研究建立了一个包含WRKY75、SA和ROS的三方扩增循环，通过不同的机制相互促进，为深入了解叶片衰老的分子调控网络提供了思路。

实验结果

WRKY75的转录受年龄、ROS和多种植物激素诱导

我们之前已经证明WRKY75促进了叶片的自然衰老过程 (Li et al., 2012)，但其潜在的分子机制尚不清楚。为此，我们首先研究了WRKY75的表达是如何调控的。利用拟南芥幼嫩、成熟、衰老前期和衰老后期四个不同发育阶段的叶片，分析WRKY75转录水平。与WRKY53和SAG12这两个典型的衰老诱导基因类似（Noh and Amasino, 1999; Hinderhofer and Zentgraf, 2001; Miao et al., 2004）（补充图1A和1B），WRKY75的表达在叶片衰老过程中逐渐增加(图1A)。为了进一步验证WRKY75的年龄依赖性调控，我们获得由WRKY75启动子驱动的GUS（beta;-葡萄糖醛酸酶）基因的转基因植物，其含有起始密码子上游的1.5kb基因组序列（ProWRKY75：GUS /Col-0）。30日龄的ProWRKY75：GUS / Col-0莲座叶的GUS染色分析显示，黄化叶片显示出比绿叶更高的GUS活性（图1B），这支持了WRKY75转录在叶片衰老过程中上调表达的发现。

我们还研究了其他衰老调节信号如植物激素和ROS对WRKY75转录的影响。我们发现，SA和H₂O₂处理后，ProWRKY75:GUS/Col-0转基因植株(图1C)的WRKY75转录水平较对照处理后的植株(图1D和1E)有显著提高(图1C)，野生型(col0)植株WRKY75转录水平的定量分析进一步证实了这一点。诱导PR1（PATHOGENESIS-RELATED GENE1; SA反应基因）(Blanco et al., 2009) 和DEFL (DEFENSINLIKE;一个H₂O₂反应基因）的表达(Gadjev et al., 2006) 确保了处理的有效性(补充图1C和1D)。其他激素，如乙烯、JA和ABA，诱导WRKY75表达，而细胞分裂素抑制WRKY75表达(补充图2A)。此外，我们发现乙烯诱导的WRKY75表达在ein3 eil1中大大减少，ein3 eil1是一种乙烯不敏感突变体，类似于ERF1，一种众所周知的EIN3 / EIL1靶基因 (Solano et al., 1998)（补充图2B和2C）。相应的，在WRKY75的启动子（补充图2D）中发现了六个推定的EIN3结合元件（TTCAAA，E1至E6）(Itzhaki et al., 1994; An et al., 2012; Li et al., 2013)。利用可诱导的EIN3-FLAG /ein3 eil1 ebf1 ebf2 (iE/qm)植物进行染色质免疫沉淀(ChIP)实验发现(An et al., 2012)，EIN3能够与WRKY75的启动子结合，特别是在E1和E4区域(补充图2E)。总的来说，这些结果表明WRKY75是EIN3的直接靶基因。

图1. WRKY75是由SA和H₂O₂诱导的衰老相关基因。

(A)WRKY75的转录水平以年龄依赖性方式增加。 Y，10日幼苗的幼叶；M，完全成熟的叶片；ES，早衰叶片，叶面积黄化lt;25％； LS，晚衰老叶，叶面积黄化gt; 50％。数据表示为平均值plusmn;SD，n = 3。实验进行三次，结果相似。

(B)携带由WRKY75启动子（ProWRKY75：GUS / Col-0）驱动的GUS转基因的30日龄植物的莲座叶的GUS染色。箭头显示具有较高GUS活性的衰老叶片区域。

(C) 用SA或H₂O₂处理的10日龄ProWRKY75：GUS / Col-0幼苗的GUS染色。 在GUS染色之前，用水（Mock）500mu;MAA或10mM H₂O₂处理幼苗2小时。

(D)和 (E)用500mu;MSA（D）或10mM H₂O₂（E）处理指定时间的10日龄的 Col-0幼苗中WRKY75表达的qRT-PCR分析。 数据表示为平均值plusmn;SD，n = 3。实验进行三次，结果相似。

WRKY75以年龄依赖的方式正向调节叶片衰老

我们之前发现WRKY75表达的减少导致WRKY75RNAi植株叶片衰老表型延迟(Li et al., 2012)。在本研究中，我们构建WRKY75过表达转基因植物(WRKY75ox)，该植物含有35S启动子驱动WRKY75编码序列。定量RT-PCR分析显示，WRKY75ox中WRKY75转录本水平是野生型(Col-0)的8- 10倍，但仅为野生型(Col-0)的10%(图2C)。与它们各自的表达水平一致，WRKY75ox植物显示出早熟的叶片衰老症状，而WRKY75RNAi植物表现出延迟的衰老表型（图2A和2B）。WRKY75ox莲座叶在24日龄时从尖端开始变黄，而Col-0和WRKY75RNAi叶在32日龄和40日龄时开始变黄（图2B）。叶片衰老过程中叶绿素含量的下降和SAG12的表

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