不同种群细基江蓠（江蓠属，红藻门）的叶绿体简单重复序列种内研究进展
原文作者Sze-Looi Song1,2dagger;，Phaik-Eem Lim1,2*，Siew-Moi Phang1,2dagger;，Weng-Wah Lee3dagger;， Dang Diem Hong4dagger;，Anchana Prathep5dagger;
单位
* Correspondence: phaikeem@um.edu.my
dagger;Equal contributors
1Institute of Biological Sciences, University of Malaya, 50603 Kuala Lumpur，Malaysia
2Institute of Ocean and Earth Sciences (IOES), University of Malaya, 50603Kuala Lumpur, Malaysia
摘要：背景：龙须菜因其高增长率和对各种环境因素的耐受性，是一种有着巨大经济潜力的洋菜植物。这种红藻用于鲍鱼饲料和琼脂的生产，在中国被大量养殖。从细基江蓠变种的叶绿体基因组中发展而来的微卫星标记能够区分来自6个不同地区的细基江蓠。其中四种来自马来西亚半岛，泰国和越南各一种。我们使用聚合酶链反应(PCR)扩增8种SSR引物对用于分析80种江蓠属植物样本。
结果：5对单核苷酸引物对和1对三核苷酸引物对呈单形等位基因，而另外两对引物对将细基江蓠样本分成两大类。来自泰国的和越南的细基江蓠被分成一组，来自巴图劳特、中班克斯和夸(马来西亚)的种群被分成另一组。从其他地区获得的这两对引物的组合数据集能够分离来自马来兰坦和马来西亚的细基江蓠。
结论：据微卫星标记重复核苷酸的变化，我们的研究显示细基江蓠种群主要分布在两大地理区域：(i)马来西亚半岛西海岸的种群和 (ii)面对中国南海的种群。细基江蓠菌株的正确鉴定具有较高的经济潜力，也有利于海藻的大规模栽培。
关键词：cpSSRs；遗传分析；单倍型；红藻
调查结果
背景
龙须菜是一种红色的海藻，它不仅分布在整个西太平洋的热带和亚热带地区[1]，还分布在印度洋地区[2]。这种红藻用于鲍鱼饲料和琼脂的生产，在中国被大量养殖[3，4]。这种品种对栽培环境的广泛耐受性、高生长速率和高琼脂产量适合栽培 [5-7]。细基江蓠在1976年第一次被长和夏描述为一个新品种，细基江蓠变种于1988年被报道[1]。 细基江蓠在越南[8-10]，泰国[11]，菲律宾[12]以及在马来西亚的夸，兰卡威岛[2]和巴图·劳特，雪兰莪 [13,14]被发现。
在海藻中，形态物种的概念仍然是是物种水平和种内研究的基础 [15]。然而，海藻以其高形态可塑性而闻名，同种海藻在不同的环境条件下生长会有广泛的形态特征。正确识别对商业开发至关重要，如种卡帕藻，江蓠，马尾藻和柯勒帕。尽管被选中同一克隆同一条件下栽培，这些品种在产量和形态特征上可能仍然不同。因此，分子标记是遗传变异的观察和利用的关键，包括基因组结构、组织和整个基因组的进化[16]。总之，分子标记提供了一个重要的工具用于评估遗传多样性的水平和模式，在先前已成功地应用于各种植物[17]。
微卫星或简单重复序列(SSRs)，是1-6核苷酸串联重复序列分布在在大多数真核生物的基因组中[18]。由于高水平的多态性，共显性遗传与相对丰富，SSRs在植物遗传育种中是各种应用程序的选择标记[20]。微卫星位点在一些海藻中已被成功识别，如红色的龙须草[21]，绿石蒜肠[22] 和棕色的甘蔗(海带)粳稻[23]。传统的SSR标记开发方法是对大量的克隆测序后生成的基因组文库中寻找含有SSR的DNA区域[24]，这是非常费力费时费钱的 [25-27]。随着许多藻类基因组的建立和表达序列标签(EST)测序项目，丰富的DNA序列信息已生成并存入在线数据库。这些高度多态的SSR标记在种质鉴定，标记辅助选择，品种鉴定、遗传多样性与系统发育关系研究中非常有用[28]。
迄今为止，微卫星标记的潜在用途在海藻已经测试了江篱[29]和坛紫菜[30 ]用于评估遗传变异性，Undaria pinnatifida探索遗传结构[31]，Porphyra sp.进行种质鉴定[32]，taxiformis Asparagopsis确定倍性水平和有性生殖[33]，以及Gracilariopsis lemaneiformis[21]和Chondrus crispus进行遗传多样性研究[34]等等。在马来西亚，分子研究一直专注于江蓠物种，通过随机扩增多态性DNA（RAPD）探究遗传关系[ 35,36 ]和通过线粒体cox1基因探究遗传多样性[37]。关于马来西亚 Gracilaria changii [38]和Sargassum binderi [39]的cDNA文库也已生成。
叶绿体DNA（cpDNA）根据单倍体而不同性质，与核基因组相比为单亲遗传和缺乏重组[15,40]。红藻中可用的质体基因组序列包括紫菜的叶绿体[41]和线粒体基因组[42]及其金鸡草的线粒体基因组[43]。2004年，Hagopian等人进行了细基江蓠变种叶绿体基因组的测序，这是花藻科(红藻纲)第一个成功完成的质体基因组[44]。Barufi等人完成了细基江蓠变种的体外生活史实验研究[45]，线粒体基因组2010年成功测序[46]。最近，细基江蓠变种的表达序列标签已经建立并存放在国家中心生物技术信息(NCBI)公共数据库[47]。这一发现显示了人们对作为功能基因组学研究的模型有机体细基江蓠的兴趣日益增加。
叶绿体SSRs(CpSSRs)主要用于植物研究，如设计cpSSRs引物用于在各种植物中放大目标区域[48]，Provan等人开发通用引物用以在禾本科植物中的活性研究[49]和一套通用的cpSSR引物的研制探索关于亚热带及热带果树作物的cpDNA多样性[50]。然而，在藻类中对cpSSRs的开发研究却很少。例如用于绿藻和红藻门中叶绿体编码和非编码区的扩增的通用引物[51]。
这项研究是为了发展细基江蓠叶绿体基因组微卫星标记，使用现有的生物信息学工具并测试从六个不同的地方的八十份细基江蓠标本进行引物分析检测来自不同种群的遗传变异。
方法
道德声明
未收集到来自任何国家公园或保护区的金边龙须菜标本。无具体收集标本需要获得许可。
样本采集与DNA提取
共收集到来自六个不同的地方的80个龙须菜标本：（1）巴图·劳特，雪兰莪，马来西亚（2）中银行，槟城，马来西亚（3）夸，马来西亚兰卡维岛（4）马来西亚基兰丹（5）金，海丰，越南和(6)彭定康，泰国 （图1）。雌配子体(单倍体)和四分体植物(二倍体) 是由其生殖确定的器官。样品在液体中被研磨成粉末。根据DNeasePlace植物迷你试剂盒(齐根，德国) 制造商的说明提取氮和DNA，可以稍作修改。将提取的基因组DNA保存在-20°C，以供进一步研究分析。
SSR发展
183883 bp的细基江蓠叶绿体基因组DNA序列从GenBank下载 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/) 并以FASTA格式保存。perl脚本是用来搜索 基因组序列数据中的微卫星串联重复序列并使用(MISA)搜索模块（http://pgrc.Ipk-gatersleben.de/misa/）。为了避免同质性，这项研究中只使用了完美的SSR（没有替换中断核心基序）和两个或更多长度重复的核苷酸。引物是使用Primer3 [52]设计，SSRs的设计的参数是以这样的方式定义的，引物的退火温度从48℃到55℃不等。长度在20-24 bp之间，GC含量在50-70%之间，预期产品尺寸在280至350bp之间。
SSR分析
聚合酶链反应(PCRS) 含1.5mu;l 10xPCR缓冲液的15mu;l （塔卡拉生物技术公司，大连，中国），0.2毫米dNTP 混合(TAKARA)，0.5 U Taq聚合酶，每对引物0.3毫米，25-50 ng基因组DNA加 UHQ水至15mu;l。扩增反应条件如下：94°C下5分钟变性，然后是35个循环，94℃1分钟，52℃1分钟，72℃2分钟延伸，最后在72℃延伸5分钟。 正向引物每对是荧光[69-羧基荧光素（FAM]）]标记。优化的退火用于PCR扩增的温度是52℃，并且这一点是测试所有样本最佳温度。扩增产物在75V 3.0％MetaPhor琼脂糖凝胶（FMC或Cambrex Corporation，USA）上分，持续75分钟，并由SYBR可视化安全染色(Invitrogen，美国)观察。放大产物被送往片段分析，使用自动DNA测序仪以检测等位基因。
数据分析
引物对在八十株细基江蓠样品中都表现出良好的扩增能力，被认为是可用的。用二值矩阵法对SSR产品进行评分。以“1”(存在)和“0”(不存在)为基础，每对引物设计的扩增模式。使用GelQuest 软件[53]构建这些来自不同地点的细基江蓠 DNA指纹图谱，基于尺寸标准模板ABI GeneScan 50-500，然后是相似性矩阵聚类，基于UPGMA分析（不加权配对组），方法使用算术手段，使用ClusterVis软件版本1.4.2 [53]。
峰高大于50%的高度为了避免背景噪音，选择了最高的峰值，被分析的扩增片段大小被设定为包括预期扩增片段的范围尺寸。聚类分析是在扩增的基础上进行的，样本的片段大小和树状图是在hyperbin宽度设置为一个值的情况下生成的，这将导致一组确定的扩增片段大小。由此产生的UPGMA树状图被可视化并使用TreeMe软件编辑[54]。
来验证这些多态性不是因为在cpSSRs两侧的地区，有三个从每一个随机选择的PCR产物对每个引物进行了纯化和测序。使用Chromas 1.45(澳大利亚Technelytipty Ltd.) 和BioEdit 7.0.9.0 [55]软件对测序数据进行分析和编辑。编辑序列由CLUSTAL X程序对齐 [56]。
结果
八种完美的SSR引物设计（表1）从183883 bp的细基江蓠变种叶绿体基因组获得。八种引物—对，五种（62.5%）进行单核苷酸重复，两种（25%）是二核苷酸重复序列，只有一种（12.5%）是一个三核苷酸重复序列。所有的研究获得了A，T或AT重复。未发现CG微卫星。所有引物对在80个来自不同的地方细基江蓠标本上测试。八个引物对显示在3％琼脂糖凝胶电泳中良好扩增。
单核苷酸引物对（GT1、GT2 GT3 GT6和GT7）和三核苷酸引物对（GT4）放大效果好但却是单态的测试样品。只有一个定义的扩增片段大小，引物对GT1为336bp，引物对GT2为312bp，引物对GT3为308 bp，引物对GT4为295 bp，引物对GT6为301 bp，引物对GT7为307 bp，表明所有样品都在同一定义扩增片段大小内。
对于引物对GT5，327bp，329bp和333bp三个确定的扩增片段大小具有相似基准峰值的样品落入相同定义的扩增片段大小（表2）。引物对GT5的树状图表明细基江蓠标本分为三个主要分支：（a）来自马来西亚吉兰丹的细基江蓠（b）来自Quy Kim，越南海防和Pattani，泰国细基江蓠以及（c）来自Kuah，Batu Laut和中间银行（马来西亚）的细基江蓠。 所有三个分支都得到了相似系数为0.5的支持。
对于引物对GT8，定义了两个扩增片段大小，284 bp和294 bp的派生，并与样品
相似的扩增片段大小在此表现出细胞值柱。引物
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