用非洲爪蟾蝌蚪建立人类神经发育障碍疾病模型 ——从机制研究到有目的的治疗外文翻译资料

用非洲爪蟾蝌蚪建立人类神经发育障碍疾病模型

——从机制研究到有目的的治疗

原文作者 Kara G. Pratt¹ 和 Arseny S. Khakhalin² 单位1.怀俄明大学 2.布朗大学

摘要：以非洲爪蟾蝌蚪为模型，在研究神经发育障碍的分子机制、细胞机制以及网络机制中有许多优势。实际上，无论是轴突生长和轴突导向还是活性依赖的稳态和细化，正常神经回路发育的每一个阶段都已经在青蛙蝌蚪中进行了研究，所以说青蛙蝌蚪模型已经成为研究神经发育某一阶段受损的理想模型。最近，该蝌蚪模型已经被用来探索癫痫和自闭症的发病机制，并且越来越多的证据表明，神经系统疾病往往涉及最基本的神经系统功能和发育出现缺陷。在这篇综述中，我们将介绍蝌蚪模型是如何用来研究三种不同类型的神经发育障碍的最新信息：接触环境毒物引起的疾病、癫痫和癫痫发作以及自闭症。

引言

神经元有惊人的自我组装成高度组织化电路的能力。这些电路产生了我们的感知，思想和情绪，并决定我们如何体验我们的世界。因此，神经发育障碍常常危及生活质量。迄今为止，对于诸如自闭症、癫痫症和精神分裂症等普遍的神经发育障碍还没有治愈方法，并且在引发这些疾病根本原因方面的研究仍存在着许多空白。允许在多层次上研究紊乱的动物模型，如从分子到行为的研究，可以更全面地了解相关基因位点和潜在机制，从而促进新的治疗和预防方法的出现。

非洲爪蟾蝌蚪具有的许多特点，使它成为了一个研究神经系统发育障碍的强大模型。首先，无论是神经形成、分化还是轴突寻路、突触的成熟以及电路改进，神经发展的每个阶段基本上都已经在非洲爪蟾蝌蚪模型上进行了较为详细的研究。(Cline and Kelly, 2012; Sanes等, 2012)这种对正常发育过程的详细了解，对于确定它们如何发生故障是非常重要的。与哺乳动物神经回路相比，虽然蝌蚪的基本结构简单，但两者同源性强。例如，在蝌蚪的网膜电路中（图1），眼睛视网膜神经节细胞（RGC）伸出它们的轴突到大脑时，它们会与对侧顶盖的顶盖神经元形成突触(Gaze, 1958; Sperry, 1963)，这一中脑结构与哺乳动物上丘是同源的。通过相邻的RGC与邻近的顶盖神经元形成突触，RGC的轴突在目标结构内形成了一个高度组织化的地形图。这反映了许多哺乳动物的感觉回路，包括人类神经系统中观察到的现象。此外，和大多数哺乳动物的兴奋性突触一样，RGC的轴突会释放谷氨酸，而顶盖神经元上有AMPA和NMDA受体(Wu等, 1996)。基于非洲爪蟾模型对胚胎学领域的贡献，非洲爪蟾神经回路发育的许多方面已经被仔细研究过，并精心地描述了关键的发展阶段。例如，目前认为，视网膜神经节细胞的轴突会在39期到达视顶盖 [受精后4-5天]（Holt，1989；Dingwell等，2000），回路形成的最活跃阶段（形态和功能上）是44期和47期之间，并通过49期使回路变得更完善和稳定（Sakaguchi等, 1984; Cline等, 1996b; Pratt和Aizenman, 2007）。

在实验上，非洲爪蟾蝌蚪有许多优点。因为它们的透明性和背部大脑的极端位置，单个活神经元的轴突和树突可以在体内成像(Harris等, 1987; Ruthazer等, 2003; Cohen-Cory, 2007; Li等, 2011; Dong和Aizenman, 2012)，甚至可以在醒着的活体动物内成像(Chen等, 2012; Hossain等, 2012)。顶盖的放射状胶质细胞延时成像成为了神经活动如何影响这些细胞的结构和功能的第一个描述方法(Tremblay等, 2009)，并且随着形态测量软件的开发(Liu等, 2009; Chen等, 2012)使得在一段时间内短间隔的追踪和测量神经活动的所有三维过程的能力得到了提高(Hossain等, 2012)。此外，蝌蚪的钙成像可以很容易地进行(Tao等, 2001; Junek等, 2010; Xu等, 2011)，包括从完整的清醒动物体内获得成像记录(Chen等, 2012; Podgorski等, 2012; Imaizumi等, 2013)。通过基于电穿孔的实验方法(Haas等, 2001; Haas 等, 2002; Bestman等, 2006)或通过mRNA注入早期胚胎的适当细胞(Demarque和Spitzer, 2010)，可以使被研究的基因在其体内表达。由于蝌蚪血脑屏障通透性较高，神经系统的药理作用通常只需要通过在蝌蚪饲养液中加入药理学试剂就可以实现(Pratt和Aizenman, 2007; Li等, 2009; Pratt和Aizenman, 2009; Straka和Simmers, 2012)。而电生理技术已成功地应用于非洲蟾蜍，以量化神经网络的连通性(Pratt和Aizenman, 2007; Li等, 2009; Pratt和Aizenman, 2009; Straka和Simmers, 2012)、突触的成熟度(Engert等, 2002; Mu 和Poo, 2006; Pratt等, 2008; Tsui等, 2010)以及细胞的本质特性(Aizenman等, 2003; Pratt和Aizenman, 2007; Winlove和Roberts, 2011)。由相应神经回路控制的行为，包括几种逃避行为(Roberts等, 2000; Wassersug和Yamashita, 2002; Dong等, 2009; Sillar和Robertson, 2009)、定向反射 (Pronych等, 1996; Simmons等, 2004; Straka, 2010)以及社会行为(Katz等, 1981; Villinger和Waldman, 2012)，已经被解释得很好了，并且可以被实验操纵，(Lum等, 1982; Jamieson和Roberts, 2000; Wassersug和Yamashita, 2002; Simmons等, 2004; Dong等, 2009; Straka, 2010)。总之，这些实验方法可以让在同一个体上的神经回路分别从分子、细胞和行为学水平上得以检验。再者人类在遗传学上更接近于非洲爪蟾，而不是类似的其他模式生物，如斑马鱼，这是因为硬骨鱼类（辐鳍鱼类）已知有不同的高度专业化的基因组(Postlethwait等, 2004; Nakatani等, 2007; Rash等, 2012)。结合相对低廉的饲养空间、一次交配可产生大量胚胎以及胚胎手术 (De Robertis, 2006; Harland和Grainger, 2011; Pai等, 2012) 和外科手术(Constantine-Paton和Capranica, 1976; Filoni, 2009; McKeown等, 2013; Elliott等, 2013) 操作的简易性，这些特性使非洲爪蟾成为神经发育研究的理想模型。

在本文中，我们首先强调了，在过去几年里蝌蚪是如何成为测定环境中的化学物质对神经发育的影响模型，以及模型本身是如何演变和完善的。然后我们介绍了最近设计的一种癫痫发作的蝌蚪模型，通过对它的研究，我们发现在癫痫发作时会激活生物体内的一种内置保护机制。最后，我们提出了一个新的蝌蚪模型用于研究自闭症。

环境毒物对蝌蚪模型发育的影响

在发育过程中，神经回路对环境中的化学物质特别敏感。举个例子，一定剂量的甲基汞会对胚胎的中枢神经系统有神经毒害作用，但是对母体的中枢神经系统却没有影响(Castoldi等, 2001)。同样的，发育中的大鼠幼体神经系统暴露在铅（一种重金属）环境中的通常会导致脑病，而成熟的大鼠大脑暴露于相同量的铅环境时则不受影响(Holtzman和Hsu, 1976)。因此，被认为对成人中枢神经无害的化学物质可能对发育中的大脑却有害。

学术界的研究人员和美国政府环境保护局（EPA）使用了几十年来测定环境化学物质的毒性和致畸作用，对胚胎毒理学领域来说已经有大量对非洲爪蟾模型的研究经验(Dumpert和Zietz, 1984; Degitz等, 2003; Richards和Cole, 2006; Berg等, 2009)。蝌蚪一直成为这些研究的对象主要是因为他们从蝌蚪到青蛙的变态完全取决于甲状腺激素（TH）(Damjanovski等, 2000)，而TH抑制剂是最常见的环境污染物，同时它也是内分泌干扰物中的一大类。蝌蚪发育过程中，如果TH分泌被抑制，那么它的变态就会停止，而相反的，如果蝌蚪变态前被暴露于TH环境中则会发生提前的诱导变态(Helbing等, 2007)。由于变态的进展很明显而且易于描述，若其发生改变很容易就能被识别。因此，这成为一个测试多类化学品对TH活性破坏力的简便方法(Gutleb等, 2000; Tietge等, 2005; Cheng等, 2011; Lorenz等, 2011)。然而，TH的主要目标之一是大脑，破坏正常的TH活性会导致神经系统发育缺陷 (Zoeller和Crofton, 2000)。这不像那些更细微的与神经发育有关的缺陷（比如突触的细化）会导致与变形有关的相对总量变化（比如尾部损失，肢芽的形成，肺的产生），神经系统发育产生紊乱时不容易察觉。因此，有必要建立一种更灵敏的分子生物学方法来识别与破坏TH相关的神经特异性分子标记。采用定量逆转录PCR实验（qRT-PCR）表明，TH抑制剂甲巯咪唑和高氯酸盐会在54期改变蝌蚪脑组织神经上TH受体的表达(Zhang等, 2006)。此外，在结合cDNA微阵列分析和实时定量PCR进行详细研究后，发现高氯酸盐会显着增加几个神经的mRNA的表达(Helbing等, 2007)，包括beta;淀粉样前体蛋白的mRNA，对这种蛋白的不当处理与阿兹海默病出现有较大关系：以及编码髓鞘碱性蛋白和髓鞘脂质蛋白的mRNA，这两个蛋白都是髓鞘使轴突绝缘和促进适当的动作电位传导的主要组成部分。这些高氯酸盐诱导的mRNA增加可能对发育中的蝌蚪大脑产生影响，但具体情况仍不清楚。

成像和电生理方法方面的进步使蝌蚪成为一个在高分辨率下研究环境化学物质如何影响发育中的神经元的强大活体模型。例如在对美洲豹蛙蝌蚪的研究中发现长期地将视顶盖神经元暴露在低量亚微摩尔级的铅中会减少RGC的轴突乔木区面积以及轴突的分支数。用同样的条件实验则发现，暴露在大浓度的铅环境下，会减弱RGC轴突和树突顶盖之间的突触传递(Cline等, 1996a)。最近以来，非洲爪蟾模型已经被用来研究亚致死浓度的甲基异噻唑啉酮（MIT；一个杀菌剂，在化妆品中比较常用，比如洗发水中）对神经系统多方面的影响(Spawn和Aizenman, 2012)。例如，整体视觉系统功能测试是通过对顶盖依赖和脑丘依赖的视觉行为的描述实现的 (Dong等, 2009)。MIT暴露下的蝌蚪只减少了顶盖依赖的视觉行为，这表明网膜突触传输出现了故障。尽管，MIT处理下的蝌蚪在RGC输入和顶盖神经元之间的突触传递之间并没有发现有所不同，但是反复循环的顶盖连接结构模式（由RGC输入激活）在某种程度上发生了改变，这表明电路缺乏完善。在单神经元水平上，MIT处理下蝌蚪的内在兴奋性和突触强度无差异。总之，顶盖依赖视觉行为的减少、不完善的顶盖连接，结合内在变化的缺少以及突触特性的丢失，表明慢性MIT处理会导致神经回路水平上的问题，而不是出现单细胞水平上的问题。对于神经毒理学研究来说，这项研究表明慢性暴露于一种对生存或者形态无明显影响的化学物质浓度下，仍然可能对发展的神经回路造成损害。总的来说，这项研究表明使用非洲爪蟾蝌蚪可以检测神经元和神经回路的细节水平，更具体地说，可以在神经回路和单个神经元水平上追踪和研究行为缺陷。

用于研究癫痫发作的蝌蚪模型

除了环境毒素外，发育中的神经回路特别容易受到癫痫活动的影响。一份可靠的报告表明，已经开发了可控的诱导非洲爪蟾癫痫发作的方法 (Hewapathirane等, 2008)并且已经深入了解了内源性多胺对癫痫发作的神经保护作用(Bell等, 2011)。

将蝌蚪模型用于研究癫痫发作，起始于对几种会引起47期蝌蚪癫痫发作的化疗惊厥药药效的详细分析。

几个不同类型的惊厥药已经进行了测试：GABA受体拮抗剂[戊四唑（PTZ），木防己苦毒素和荷包牡丹碱]、谷氨酸受体激动剂（酸）、毒蕈碱受体激动剂（碱）和钾通道抑制剂（4-氨基吡啶）(Hewapathirane等, 2008)。在蝌蚪模型的测试中，所有这些惊厥药都引发了同一个类型的行为发作。这些行为起始于蝌蚪快速的间隙性游泳，然后会异于常规头朝下、尾朝上的姿势禁止不动，紧接着出现头部的横向运动，最后出现完全的癫痫发作行为——由于单侧轴向肌肉收缩异常强烈而诱发的C型收缩，以至于整个蝌蚪呈现完整的C型。因为所有不同类型的惊厥药引起的癫痫发作的类型相同。因此认为，这是一种“真正的”癫痫发作，而不是特定药物对运动功能的影响。对于蝌蚪癫痫模型来说，GABA受体拮抗剂PTZ被认为是最佳的化疗惊厥药，因为靠它来诱导典型的C型收缩而使用剂量，既不致死也没有毒，并且在视顶盖的活体场电位记录中显示出强大的癫痫样活动，即出现场电位高幅飙升，以此作为对PTZ使用的反应。这种癫痫样活动可以通过抗癫痫药物丙戊酸钠的使用而完全阻断。该模型的优点是，在电生理学或影像学实验过程中，蝌蚪的固定可以使用可逆的瘫痪或琼脂浸泡实现，从而可以在不使用麻醉剂的情况下研究癫痫发作(Hewapathirane等, 2008)。

最近，在贝尔等人(Bell等, 2011)结合两次连续PTZ诱导的癫痫发作，用行为学、电生理学和药理学实验研究表明，第一次PTZ诱导的癫痫发作增加了多胺的产生[在啮齿动物癫痫模型中也有一个类似的

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