利用牛粪可持续生产家蝇幼虫作为高蛋白饲料原料的研究

原文作者 Mahmoud Hussein¹, Viju V. Pillai¹, Joshua M. Goddard¹, Hui G. Park², Kumar S. Kothapalli², Deborah A. Ross¹, Quirine M. Ketterings¹, J. Thomas Brenna², Mark B. Milstein³, Helene Marquis⁴, Patricia A. Johnson¹, Jan P. Nyrop⁵, Vimal Selvaraj^1*

单位 1美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院动物科学系，2美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学营养科学系，3美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学约翰逊管理研究生院，4美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学兽医学院微生物学和免疫学系，5美国纽约州日内瓦康奈尔大学纽约州农业实验站昆虫学系

摘要：在环境中，家蝇是营养物质循环中较为重要的部分。利用家蝇去降解粪便给减少废物处理提供了机会，与此同时，快速同化的昆虫生物量也可以用作富含蛋白质的动物饲料。在这项研究中，我们发现利用家蝇幼虫生物降解乳牛粪便，并且由此产生的家蝇幼虫粉具有一定的营养价值可以作为一种饲料原料。我们的结果说明乳牛粪便在家蝇幼虫生长方面是一种较为均衡的营养基质，并且在降解粪便方面，数据显示以总氮（24.9%）和总磷（6.2%）总质量的减少。幼虫在一个最佳密度下的产量大约是粪便重量的2%。营养分析家蝇幼虫粉的蛋白质含量与大多数高蛋白饲料相当。家蝇幼虫粉中蛋白质含量为60%，氨基酸组成平衡，脂肪含量为20%，单不饱和脂肪酸占57%，饱和脂肪酸占39%，幼虫粉缺乏任何大量的欧米伽 3脂肪酸。对幼虫粉中微量元素的分析表明，幼虫粉是钙、磷元素的良好来源（分别为0.5%和1.1%）。幼虫粉的营养价值与鱼粉相近，使得它是一种潜在的有吸引力的蛋白质饲料替代品，且可以将其应用于牲畜养殖中和水产养殖中。

引言：

牲畜为人类提供重要的蛋白质来源。相反，在高密度畜牧业生产领域中，牲畜产生粪便的污染是主要的管理挑战。美国农场每年生产超过3.35亿吨的肥料（干物质）^[1]。在动物密度高、出口选择有限的地区,粪便总生成量超过可以安全应用于农业土地肥料用量^[2]，导致水体富营养化，污染地面水和产生疾病的威胁^[3]。在大多数情况下，与粪便处理和出口相关的成本会一直渗透到消费者身上^[4]。

与此同时，为了满足持续不断增长的人口数量，全球对牲畜和水产养殖产品的需求不断增加，这给环境和粮食安全方面带来了新关注。饲料成分的花销大致占到畜牧业生产花销中60%-70%，这正成为经济增产的一大挑战。人类和动物系统之间对一些共同主食资源引发了竞争，并对可耕地造成压力；据估计表明，牲畜已经占到所有农业用地的70%^[5]。此外，水产养殖、家禽和养猪作业对鱼粉等高营养价值的动物性蛋白质来源的需要，导致了商业捕鱼的扩张，这种情况是不可持续的^[6]。在2010年，据计算，73%的鱼粉和71%的鱼油生产用于水产养殖^[7]。海洋资源的开发对生态环境造成了不利影响，减少了野生鱼类资源以及改变了海洋栖息地^[8-9]。因此，人们一直在寻求可持续的高质量“替代”蛋白质成分，此成分能降低对环境和与畜牧业生产密切相关的成本。

不考虑环境问题，还面临着确定替代性高蛋白饲料原料的压力，这些原料可以替代哺乳类动物的肉和骨粉喂养牛、羊和山羊，以避免出现诸如牛海绵状脑病（BSE）等朊病毒疾病的风险^[10]。但是，要求在水产养殖饲料中加入动物源性蛋白质，与植物源性蛋白质相比具有很高的生物价值^[11-12]，以及在高质量家禽饲料中加入动物源性蛋白质^[13-14]，使得完全替代品的选择非常少。

早在20世纪30年代，在两次世界大战之间的时期，对食物的需求引发了让昆虫作为食物的探索^[15]。在20世纪70年代和80年代，有关人员进行了更加系统的研究，展现了在水产养殖和畜牧业生产中，使用特定种类昆虫幼虫的一些独特潜力^[16-21]。然而，由于鱼粉供应充足且成本有效，当时没有什么动力推动商业“幼虫粉”饲料企业。根据最近的估计，到2050年，粮食生产需要几乎翻一番，以容纳90亿人口^[22-24]，因此迫切需要重新评估畜牧业生产系统，以实现可持续性和提高效率，同时尽量减少废物产生和对环境的影响。食用昆虫是一种快速的生物燃料发生器，作为废物的饲料和降解物具有特殊的价值^[25-26]。因此，最近的几项研究重新审视了作为不同畜牧业饲料原料的特定昆虫种类^[27-32]。

许多种类的双翅目昆虫在动物粪便中自然地完成它们的生命周期。几十年来，人们一直在考虑利用家蝇（Musca domestica）在垃圾转化地同时能够产生高蛋白饲料^[17]。或许，在牛粪上饲养幼虫的想法最初考虑时并没有引起公众的兴趣，或者苍蝇逃跑的过程和不受欢迎的事故可能会成为一种威慑^[33]。目前，随着需求的增加和自动化生物生产系统技术的进步，似乎有必要重新讨论这个课题的调查和计划其商业潜力。

在本研究中，我们进行了实验，以评估利用奶牛粪便饲养的家蝇作为动物饲料的可行性。我们研究了幼虫的发育、存活和行为与粪便中幼虫密度、粪便降解和粪便中幼虫营养含量的关系。

材料与方法

家蝇群落

在康奈尔教学谷仓附近捕获的成年家蝇被用来建立繁殖地。蝇笼（50 x 50 x 50 cm; BugDorm, MegaView Science, Taiwan）用来饲养成虫。对于每个繁殖周期，将大约750只家蝇（刚出蛹）饲养在每个笼子中，持续3周。在此期间，笼子需要被清洁和消毒，以供新的年轻种鸡使用。笼子里的水是用装有突出的棉芯作为饮水场所。将奶粉和白砂糖的混合物（1:1的比例）放置在开放的容器中，作为果蝇的食物。笼子被放置在光照时间为12小时、黑暗时间为12小时、温度为25plusmn;2℃、环境湿度（40-60%）的房间中。

产卵

从羽化后5天左右开始，在100mm的培养皿中以100克牛粪的形式提供产卵基质。在3周内，果蝇每48小时排卵4小时。卵用一种改良的悬液分离方法。简而言之，将卵团转移到0.8M的蔗糖溶液中，从上层收集搅拌后的浮卵，卵在水里清洗三次，去除杂质和蔗糖。最后用75mu;m不锈钢过滤器（EmCon过滤器，Agtech, Inc.， USA）冲洗卵，短暂风干，在显微镜下评估完整性然后称重。卵被悬浮在水中（5mg卵/ml，大约75个卵），以便在使用前立即分发。

粪便和家蝇幼虫的处理

新鲜的牛粪是直接从康奈尔教学乳品场的地板上直接收集，运输到实验室及时实验，或在4℃下储存，并保持85%的水分含量，使用2-3天。所有幼虫的生长/迁移和粪便降解实验均在恒温箱(H: 250cmtimes;W: 300 cmtimes;L: 300 cm)中进行，调节温度为28plusmn;2℃，相对湿度为60-70%，光周期为环境光12h和黑暗12h。在不将幼虫移出该室的情况下监测卵孵化、幼虫生长和行为。孵育和分析取决于实验目标。幼虫粉营养分析时，将上述配制的卵悬液均匀洒在粪便上;50毫克(10毫升悬浮液)用于250克肥料的塑料容器(高:8厘米times;宽:12厘米times;长:30厘米)。幼虫在3龄(约5-6天)化蛹前被收获，用水冲洗，干燥，-20℃保存直至分析。

幼虫密度和生长

使用限定量的粪便和卵，估计卵播种密度对家蝇幼虫总收获重量的影响。将新鲜采集的粪便样品(25 g)与不同密度的卵(1、2、4、8或16个卵/g粪便)混合。监测幼虫的孵化和生长情况，并测量幼虫生长5天后的最终收获重量(包括个体和总重量)。平均幼虫重量用收获的总重量除以收获的幼虫数量计算。存活率计算为收获的幼虫数与粪便样本中的卵数之比。通过让幼虫化蛹（8-9天），评估不同卵掺入密度下的化蛹率。

幼虫迁移

在发育过程中，利用透明塑料容器(高:15cmtimes;宽:8cmtimes;长:8cm)评估粪便中幼虫的迁移情况。在这个容器里，将覆盖10厘米深的肥料和大约150只卵覆盖在一起，让它们孵化。在幼虫发育期间监测幼虫在粪柱内的迁移。幼虫从容器表面到达的最深点是通过沿容器壁可见的挖洞痕迹来测量的。深度由三个容器所测深度作平均值得到。

为了检查随着卵掺入密度的增加，幼虫移出/流出的速率，将新鲜采集的粪便样品（25g）与不同密度的幼虫（1、3、5、7、1日龄幼虫/g粪便）混合在一起）。在随后的生长和化蛹7天内观察幼虫的生长和外移。迁出率的计算方法是将幼虫在5、6和7天时离开容器边缘的幼虫数量与加入粪肥中的幼虫数量之比。

粪便降解

为研究幼虫密度对粪便降解的影响，将25g的粪便掺入0(对照)、1、2、4、8或16个卵/g的粪便中。5 d后采集/移走幼虫，收集粪便，晒干，称重。以各组粪便质量相对于对照组变化的百分比来计算粪便降解。根据密度和生长的研究结果，利用幼虫的最佳数量来评估幼虫生长对肥料组成的影响。1日龄幼虫(3条/g粪便)用装25 g粪便的容器保存，用纱布盖住，置于环境室中。7d后采集幼虫(包括部分蛹)，收集粪便，称重并分析其组成。收集相同处理方式的粪便作为对照。

常规分析

在布鲁克赛德实验室（俄亥俄州新不莱梅市，美国）使用标准方法分析粪便和幼虫的成分。样品经烘箱干燥，以测定干物质含量(根据AOAC #930.15)。使用Elementar Vario max CN仪器（Elementar AnalyzeSysteme，Hanau，Germany）上的燃烧分析测定总氮（N）含量；总蛋白质含量以6.25为标准因子(根据AOAC #990.03)。灰分含量是在马弗炉中测定的，样品在600℃下进行分析（根据AOAC #942.05）。按AOAC法#962.09、973.18和2002.04分别测定粗纤维(CF)、酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)。粗脂肪的测定通过乙醚萃取和分析(根据AOAC修改#920.39)。

矿物分析

首先，利用微波溶剂萃取系统(MARS,CEM Corporation, Mathews, NC, USA)对干燥肥料样品进行硝酸和过氧化氢消化(CEM Corporation, Mathews, NC, USA)，估计其矿物质含量。采用电感耦合等离子体质谱(Thermo 6500 Duo ICP, Waltham, MA, USA)分析钙、磷、钾、镁、钠、硫、铁、锰、铜和锌的含量。

氨基酸分析

样品分析了不同的必需氨基酸(EAA:色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和苯丙氨酸)和非必需氨基酸(NEAA:甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)。氨基酸的分析使用前面描述的方法[35]进行。简而言之，对每个样品重复使用三种水解程序，分别使用盐酸，或在盐酸之前使用过甲酸氧化，或使用氢氧化钡。然后使用锂离子交换柱（4 x 100mm，P/N 0354100，Pickering Laboratories，Mountain View，CA，USA）以三级缓冲梯度（Li292、Li365和Li375，Pickering Laboratories，Mountain View，CA）和柱温梯度（33、42、60和70℃）分离氨基酸。使用32Karat软件(BeckmanCoulter，Inc.，Fullerton，CA，USA)在高效液相色谱系统上柱后衍生化后在560 nm处检测。

脂肪酸分析

样品(200 mg)均质化，并使用标准方案提取脂质^[36]。提取物在1%甲醇硫酸中于40℃下过夜甲基化，然后使用所述的改进方案进行转甲基化^[37]。所得脂肪酸甲酯（FAME）溶解在庚烷中，并在-20℃下储存，直至分析。使用HP5890系列II GC-FID和BPX 70柱（长度：60 m，内径：0.32 mm，胶片：0.25mu;m；Hewlett-Packard，Palo Alto，CA，USA）定量分析FAME，H 2用作载气，以及气相色谱-共价加合物-化学电离串联质谱（GC-CACI-MS/MS）的GC火焰离子化检测器和结构鉴定，如前所述^[39–42]。使用等重FAME混合物（68A；Nu Chek Prep，Inc.，Elysian，MN，USA）计算每日反应系数^[41]。所有气象色谱分析都是重复进行的。

鱼油补充肥料

为了测试改变粪便中的脂肪酸是否会改变特别缺乏omega-3脂肪酸的幼虫的内源性脂肪酸组成，含有omega-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA为30%；阿里斯塔工业公司，威尔顿，康涅狄格州），将其与粪肥(1 ml/25 g新鲜粪肥)混合，按1幼虫/g粪肥的密度在环境箱中培养5天。采集粪(对照)和鱼油富集粪(处理)中幼虫，清洗匀浆，进行脂肪提取和脂肪酸

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