脉冲超声对鸡肌原纤维蛋白流变学和结构特性的影响

原文作者：Jing-yu Wang, Yu-ling Yang, Xiao-zhi Tang, Wen-xi Ni, Lei Zhou

单位：南京财经大学食品科学与工程学院

摘要：研究了不同时间（0、3、6、9、12和15min）脉冲超声（PUS）（功率240w）对鸡肌原纤维蛋白（CMP）流变学和结构特性的影响。PUS处理能显著降低CMP溶液的粘度系数（k），但在短时间（0～6min）内使其流动指数（n）增加，而在较长时间（9～15min）内无显著影响。此外，在6min时，CMP样品的溶解度和微观结构均达到最佳。PUS处理对CMP的一级结构没有影响。然而，拉曼光谱显示，在PUS处理后，CMP的alpha;-螺旋和beta;-片比例降低，beta;-圈增加。无规卷曲在6min达到最大值，PUS处理后CMP的三、四级结构也发生了变化。随着PUS时间的延长，ANS荧光探针法测定CMP的S0-ANS增加。然而，760cm^-1的归一化强度拉曼光谱从0min增加到6min，然后减少到15分钟。在0～6min内，样品的活性硫（SH）和二硫键（S-S）含量增加，而总SH含量下降，9min及以上时，活性SH基团的含量几乎等于总SH基团的含量。差示扫描量热法（DSC）显示，肌球蛋白的峰值温度（T_d2）和肌动蛋白的峰值温度（T_d3）在治疗前6min均降低，而在治疗后9min未观察到T_d3。因此，6min是获得较好的CMP流变性能和结构性能的最佳时间。

关键词：鸡肌原纤维蛋白；脉冲超声；静态流变；结构；疏水作用；二硫键

介绍

脉冲超声（PUS）是一种创新技术，最近在食品加工行业受到了广泛关注^[1]，特别是在改变肉类的嫩度和生物物理特性方面^[2]。PUS是一种弹性机械振荡，在20～1000kHz范围内，与人的听阈不同。PUS对流动系统的影响主要归因于空化效应^[3]。超声振荡通过液体系统产生周期性的压缩和膨胀，产生空化泡，并在几个周期内长大，然后剧烈坍塌，这是引起物理化学性质变化的主要原因^[4]。PUS产生的高剪切能波和湍流会打断分子间的化学键，从而导致更多反应位点的暴露，从而加速反应^[3]。

蛋白质结构方面的一些研究已经探索了PUS的应用^[5]。例如，Hu等人^[6]报道，PUS可以增加大豆分离蛋白的表面疏水性和溶解性，从而导致蛋白质流变特性的变化。此外，由于PUS的应用，可以通过改变蛋白质的二级结构来改变苍白、柔软和渗出（PSE）肉的功能^[7]。Guuml;zey等人^[8]报道，PUS处理后分子结构发生变化，分子内迁移率和表面活性提高，游离巯基和蛋白质二级结构增加。Krescaron;ictal^[9]发现，由于使用超声波处理，乳清蛋白的二级结构发生了微弱的变化。类似地，在脓后黑豆蛋白的表面疏水性和粒径通过增加分子间疏水相互作用的破坏而增强，加速蛋白质分子运动^[10]。因此，脓可能是改善蛋白质功能的有效途径^[3]。

拉曼光谱被广泛用于分析蛋白质的二级结构而不受干扰，并且操作简单^[11]。色氨酸是一种疏水性氨基酸，正常化后760cm^-1附近拉曼光谱带的强度分配给色氨酸残基上吲哚环的拉伸振动，可以用来反映蛋白质疏水相互作用的变化^[12]。-SH和-S-S之间的转换可以用来反映蛋白质分子三级和四级结构的改变^[13]。光谱带（500-550cm^-1） 是拉曼光谱中S-S的特征频率。含胱氨酸残基的肽或蛋白质分子在510cm^-1处出现特征峰能表明S-S拉伸振动引起的蛋白质构象不规则。525cm^-1波段和540cm^-1还可能反映S-S的构象，分别称为其高-高-反式和反-高-反式^[11]。然而，关于PUS处理的CMP的流变学和结构特性的资料很少。利用拉曼光谱研究蛋白质的三级和四级结构的报道很少。因此，利用拉曼光谱研究PUS处理后CMP三、四级结构的变化具有重要意义。本研究的目的是探讨脓液处理时间对CMP流变特性和结构特性的影响，并获得一个有利于脓液在食品加工中应用的最佳时间。

材料和方法

化学药品

从Sigma-Aldrich公司购买乙二胺四乙酸（EDTA，CAS:60-00-4）、5，5二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB，CAS:69-78-3）、8-苯胺基-1萘磺酸（ANS，CAS:82-76-8）、乙二胺四乙酸（EGTA，CAS:67-42-5）和尿素（CAS:57-13-6）。（美国密苏里州圣路易斯）。牛血清白蛋白（BSA，CAS:9048-46-8）购自中国上海国药化学试剂有限公司。

动物与处理

商品母鸡（6周龄，AA型，2.5～2.6kg）购自南京青龙山养鸡场。在购买当天，根据标准^[14]，屠宰前对整只肉鸡实施安乐死。鸡胸肉被集中在一起，并立即储存在0℃到4℃保存4h，然后在-18℃保存一个月内就用完了。每次提取时，冷冻肉在4℃在实验室中放置15min，然后修剪乳房肌肉，去除多余的脂肪和结缔组织，并切成0.4-0.5cm^-3的切片。根据Zhang等人^[15]的方法从鸡胸中提取和纯化CMP。以BSA为标准，采用缩二脲法测定CMP微丸中蛋白质含量。

脓液处理

在磷酸盐缓冲液（0.6mol L^-1KCl，0.01 mol^-1KH2PO4），pH值为6.0。一个装有20ml化学机械抛光溶液的50ml玻璃双壁烧杯由一个超声波处理器（JY92IIN，中国宁波科学兹生物技术有限公司）进行超声波处理，配备一个20kHz的超声波探头（直径6cm），处理时间分别为0、3、6、9、12和15min（实时和非实时脉冲持续时间分别为1s和3s）。在超声处理过程中，仪器输出的设定功率为240W，样品连续浸入冰水浴中，以保持样品温度为4℃到8℃、 未经脓液处理的标本作为对照。

蛋白质溶解度测定

CMP的溶解度是按照Antilde;oacute;n等人的描述进行测量的，（^[16]稍作修改。一份5ml化学机械抛光溶液（5mg/ml^-1）以10000g离心20 min。将CMP分散液（1mL）添加到4 mL缩二脲试剂中并手动混合。混合物的温度是25℃逆光30分钟。使用紫外-可见分光光度计（U-3900，日立公司，日本东京）测定540nm处的吸光度。蛋白质溶解度（%）表示为上清液蛋白质浓度与离心前蛋白质浓度的比值。

静态流变测量

CMP溶液的静态流变测量（30 mg/mL^-1） 使用旋转流变仪（MCR302，Anton Paar，Graz，Austria）进行测量，该流变仪配有平行板（PP50，直径50 mm，间隙0.5 mm）。所有测定均在以下条件下进行：0.02的应变，0.1Hz的恒定频率和0-1024 s^-1剪切速率范围。同时，用幂律方程tau;=k˙delta;ⁿ (2)估算了不同PUS时间的粘度系数（k）和流动指数（n）值，其中tau;是剪切应力（Pa）；delta;是剪切速率（s^-1）；n为流动指数，k为一致性指数(Pa序列号)。

形态结构测量

使用扫描电子显微镜（SEM）（TM 3000，Hitachi Corporation，Tokyo，Japan）对CMP的形貌进行了分析times;2000和15kV加速电压。30 mg/mL^-1的CMP悬浮液在免费烘干机上冷冻（FreeZone 4.5 Plus，Labconco，Kansas City，MO，USA）。在使用SEM之前，样品在氩气氛中用金包裹，厚度为10毫米^[17]。

氨基酸分析

氨基酸含量的测定采用了Zhang等人^[18]的方法，并做了细微的修改。将与第2.6节样品相同的冻干CMP样品（2g）与6M HCl混合在10 mL加盖玻璃管中，并在110℃下水解，在烤箱里烤1天。样品冷却到25℃并用旋转蒸发仪浓缩干燥。用0.02M HCl重新溶解干燥样品，并将其转移至50mL的容量瓶中，并使用去离子水（美国马萨诸塞州波士顿Milli-Q，Millipore）将其最终体积定为50 mL。将约2ml溶液转移至离心管中，以10000g离心5min，并用0.22mm膜过滤。然后将滤液转移到2 mL小瓶中，在自动氨基酸分析仪（L-8900，Hitach Corporation，Tokyo，Japan）上进行氨基酸分析。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS–PAGE按照Zhang等人^[12]的方法进行，并进行了一些修改。对于样品制备，CMP溶液（0.5mg/ml^-1） 在样品缓冲液（1M Tris–HCl、50%（v/v）甘油、20%（w/v）b-巯基乙醇、10%（w/v）SDS和1%（w/v）溴酚蓝）中稀释1:4，并在100℃下加热保持3min，并在凝胶运行前冷却。使用10%分离凝胶和4%堆积凝胶。分子量标记来自43 kDa至200 kDa（中国北京Solarbio科技有限公司）。将小份（10mu;l）样品装入凝胶中。电泳是在垂直单位进行的（微蛋白Tetra系统，BIO-RAD，美国），带有运行缓冲液（0.05M Tris–HCl、0.384 M甘氨酸和0.1%SDS，pH 8.3）。在80 V下进行电泳，直到蓝色到达分离凝胶至120 V。凝胶用考马斯亮蓝（R-250）染色1 h，并用含有100 ml/l甲醇和100 ml/l乙酸的溶液脱色。

CMP的拉曼光谱

用Jobin-Yvon-LabramHR800光谱仪（Horiba/Jobin）测量了PUS对CMP二级结构比例、疏水作用和二硫键的影响。Yvon，法国隆朱梅）。蛋白质的酰胺键有一些不寻常的振动带（500-1700cm^-1)^[19]。酰胺I带集中在1640-1645cm^-1和1680–1690cm^-1（beta;转弯），1645–1660cm^-1（alpha;螺旋），1660–1670 cm^-1（随机线圈），1670–1680 cm^-1（beta;片），760 cm^-1（色氨酸）和500-550 cm^-1分别为（S-S债券）^[18]。测量前，所有CMP溶液的浓度为60mg/ml^-1,分别在6个玻璃镜片上放置1个不同的脓液处理时间（0-15min）。采用以下条件记录拉曼光谱：激光功率100mw，光斑直径1mm，光谱分辨率2.0cm^-1每个样本扫描3次。每一次扫描都与1003cm^-1处的苯丙氨酸带标准化。CMP二级结构（a-螺旋、b-片、b-匝和无规线圈）的百分比根据Lv等人^[20]计算。

表面疏水性测量（S0-ANS）

ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸盐）用于检测蛋白质表面疏水性。0.5、0.25、0125和0.0625mg/mL^-1的CMP样品（2mL）与10mu;L ANS溶液（8mm）混合并在室温（RT）下静置20min。在荧光分光光度计（日本日立公司F-7000）上检测以下参数下的CMP荧光强度：激发波长374nm；发射波长485nm；发射星400nm；发射端600nm；扫描速度，240nm/min^-1、延迟0.4s。绘制荧光强度与蛋白质浓度的关系图，初始斜率作为S₀的指标。

巯基（SH）的测定

在分光光度计（日本日立公司U-3900）上以摩尔消光系数（1.36times;10⁴M^-1cm^-1）测量CMP的总SH基团含量使用Liu等人^[21]描述的方法。将含有8M尿素和10mM EDTA的缓冲液（4.5mL）和100 mL Ellman试剂（10mM DTNB在0.1M NaH2PO4缓冲液中）添加到0.5mL CMP溶液（0.5 mg/mL^-1），混合均匀，在25℃避光条件下保持25分钟。在无尿素的缓冲液中，用同样的程序计算反应性巯基含量。去离子水用作参考。

差示扫描量热法（DSC）测量

DSC数据由Perkin Elmer DSC（DSC 8000，Perkin Elmer instruments，Waltham，MA，USA）获得。准确称量经PUS处理的CMP样品（10 mg）并密封以供分析。空白是一个密封的空平底锅。DSC从20到100℃以10℃/min^-1记录。利用美国Perkin-Elmer仪器公司的Pyris-12软件，根据热谱图计算出热焓（△H）和峰值温度（T_d）。

数据分析

所有实验一式三份。采用spss17.0软件进行统计分析。所有数值均表示为平均值plusmn;标准差（n=3）

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