单剂量mRNA疫苗为hACE2转基因小鼠对SARS-CoV-2的感染提供了长期的保护作用外文翻译资料

单剂量mRNA疫苗为hACE2转基因小鼠对SARS-CoV-2的感染提供了长期的保护作用

Qingrui Huang ^1,8, Kai Ji ^1,2,8, Siyu Tian ^1,2,8, Fengze Wang ^1,2,8, Baoying Huang³, Zhou Tong^4,5,Shuguang Tan⁴,Junfeng Hao ⁶, Qihui Wang ^1,4, Wenjie Tan ³, George F. Gao ^2,4,7 amp;Jinghua Yan ^1,2,4

摘要：COVID-19大流行的迅速蔓延使研制SARS-CoV-2疫苗成为全球卫生和经济的优先事项。 利用多功能性和快速发展的优势，三种SARSCoV-2 mRNA候选疫苗已进入两剂免疫方案的临床试验。然而，SARS-CoV-2感染后恢复期患者的抗体反应减弱，以及人类再次感染的出现，引起了人们对SARS-CoV-2疫苗保护时间短的普遍担忧。 在这里，我们开发了一种脂包形式的核苷修饰mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2 RBD，称为mRNA-RBD。 mRNA-RBD单次免疫可激发强大的中和抗体和细胞反应，并对hACE2转基因小鼠肺部的野生SARS-CoV-2感染提供了近乎完全的保护。 值得注意的是，在血清转移研究中，mRNA-RBD疫苗诱导的高水平中和抗体反应至少可以维持6.5个月，并对hACE2转基因小鼠对SARS-CoV-2感染具有长期显著的保护作用。 这些数据表明，单剂量的mRNA-RBD对SARS-CoV-2的挑战提供了长期保护。

1中国科学院微生物研究所，中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室，北京。2中国科学院大学，北京; 3中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，生物安全重点实验室，北京；4中国科学院微生物研究所中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京。5山西省高等研究与创新研究院，太原，中国。6中国科学院生物物理研究所蛋白质研究核心设施，北京。7中国疾病预防控制中心，北京。8这些作者贡献相当:黄庆瑞，纪凯，田思宇，王丰泽。

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已成为一场严重的全球大流行病^1-6。SARS-CoV-2在人与人之间传播效率很高，截至2020年8月25日，全球216个国家和地区已有2300多万的确诊病例和80万的死亡人数。 COVID-19的症状可从轻微症状到严重肺损伤甚至多器官衰竭，最终可导致死亡，特别是对于伴有其他疾病的老年患者^7-9。COVID-19大流行造成了与 SARS-CoV-2感染相关的高死亡率和发病率，为了试图阻止该疾病的发展而进行经济和社会封锁，还导致了全球经济危机。目前还没有针对 SARS-CoV-2感染的预防或治疗药物，这突出表明迫切需要一种安全有效的疫苗以阻止目前的疫情，并且预防新的潜在疫情的爆发。

SARS-CoV-2属于冠状病毒科的beta;冠状病毒属¹⁰。与其他人类冠状病毒一样，SARS-CoV-2表面刺突糖蛋白(S)可以被切割成S1和S2亚结构域，其中位于S1亚结构域C末端的受体结合域(RBD)与人血管紧张素转换酶2 (hACE2)作为受体，S2介导膜融合。全长S蛋白和RBD都能诱导高效的中和抗体和细胞免疫^11-14。因此，它们被广泛选择为SARS-CoV-2疫苗的抗原^12,15-20。

由于疫苗抗原RBD可以将免疫应答集中在干扰受体结合上，理论上与全长S抗原相比，诱导抗体的风险较低，容易介导抗体依赖性增强（ADE）感染^16,21,22。许多强效单克隆抗体也被分离出来，主要针对RBD^23-28。我们和其他研究小组已经确定了SARS-CoV-2 RBD与hACE2复合物的晶体结构^29-31，这些内容进一步提高了我们对该疫苗抗原的认识。因此，RBD是SARS-CoV-2疫苗开发的理想靶点。

目前多种针对感染性疾病或癌症的候选mRNA疫苗正在临床开发之中，而mRNA疫苗具有安全、快速开发和强免疫原性等优点，特别是脂质体包封形式的mRNA疫苗³²。迄今为止，已有3种SARS-CoV-2 mRNA候选疫苗进入临床试验，分别是编码病毒S蛋白的mRNA-1273(来自美国)^1,33、表达RBD蛋白的BNT162b1(来自德国)³⁴和编码RBD蛋白的ARCoV(来自中国)²¹。此外，mRNA-1273于2020年7月27日进入III期临床试验，仍然是对抗SARS-CoV-2的主要候选疫苗之一。三种临床mRNA疫苗均应用于双剂量免疫方案^21,33,34。最近，一种单核苷修饰的mRNA疫苗已被证明可引发针对SARS-CoV-2的强大的细胞和体液免疫反应³⁵。然而在动物模型中，单次mRNA接种对野生型SARS-CoV-2的保护作用研究很少。

人类冠状病毒感染后的中和抗体(NAb)反应持续时间对于防止再次感染至关重要。根据最近的研究，在应对严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)或中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)感染时，个体中持续的IgG或NAb水平通常可以维持2年以上^36-38，在SARS-CoV-2感染后恢复的人中，NAb反应在感染后仅持续2-3个月的比例很高^39-41。SARS-CoV-2感染后的短暂Nab反应更类似于对地方性季节性冠状病毒(与普通感冒相关的病毒)的免疫反应，也有报道称后者是暂时的⁴²。此外，疾病严重程度可增强NAb对SARS-CoV-2感染的反应程度，但不影响NAb反应的动力学³⁹。对于那些在感染SARS-CoV-2后出现严重症状的患者，Nab滴度在18-65天内下降了2-23倍³⁹。值得注意的是，最近记录了首例人再感染病例，这是在第一例感染痊愈几个月后发生的⁴³。SARS-CoV-2感染后NAB反应减弱，引起了人们对疫苗保护时间较短的广泛关注。由于最近在人群中出现了SARS-CoV-2，目前缺乏关于疫苗诱导保护时效的信息。在此，我们评估了单次RBD编码mRNA免疫对野生SARS-CoV-2的保护效果，研究了免疫后6.5个月内体液反应的动力学，并证明了hACE2转基因小鼠免疫血清对SARS-CoV-2的感染具有长期保护作用。

图1 mRNA-RBD疫苗的构建与鉴定。

a mRNA-RBD疫苗设计示意图 SARS-CoV-2 mRNA编码SARS-CoV-2武汉/IVDC-HB-01/2019株的信号肽(SP)、受体结合域(RBD)。

b mRNA-RBD转染HEK293T细胞。 western blotting检测细胞裂解液和上清液中RBD的表达。 c动态光散射法测定LNPs的粒径。

d具有代表性的mRNA包封后LNPs溶液的低温电子显微镜图像。 比例尺，100纳米。

e pH值4.0和7.4时LNPs的Zeta电位。

对于b和d，进行了两个独立的实验，得到了相似的结果。 对于c和e，给出了三个独立实验的一个具有代表性的结果。 源数据作为源数据文件提供。

实验结果

SARS-CoV-2 mRNA RBD疫苗的构建与鉴定。我们设计了一种mRNA疫苗，该疫苗编码SARS-CoV-2株HB-01的RBD糖蛋白(图1a)，含有修饰核苷N₁-甲基-假尿苷，以防止先天免疫传感，并增加mRNA在体内的翻译⁴⁴。然后通过转染HEK293T细胞对SARS-CoV-2 RBD编码mRNA (mRNA-RBD)的表达谱进行表征。结果表明，RBD被有效地产生并分泌到HEK293T细胞的上清中(图1b)。为了在体内诱导mRNA高效和延长抗原表达，我们进一步用脂质纳米粒(LNPs)包封制备mRNA- RBD用于疫苗接种⁴⁴。基于核糖体绿荧光试验，mRNA-RBD的包封效果大于92%。LNPs在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的动态光散射表明，其平均粒径为78 nm(图1c)， PDI较窄，为0.117。低温电子显微镜分析显示，mRNA-RBD包裹的LNPs表现出电子密度高的核(图1d)。Zeta电位测量显示，随着Zeta电位从pH 7.4时的minus;5.8 mV增加到pH 4.0时的 12.7 mV，表面电荷被观察到电离(图1e)。这些数据表明，LNPs可以响应pH的变化，在酸性pH下破坏核内体膜，释放mRNA到细胞质中。

为研究mRNA-RBD LNPs在体内产生RBD的持续时间和分布，用15 mu;g mRNA-RBD LNPs肌注(i.m.)免疫BALB/c组小鼠(n = 16)，并以LNPs包覆的多胞苷酸(Poly(C))RNA作为安

慰剂对照组。注射后6、12、24、48 h，每组4只小鼠安乐死，取血清、肌肉、肝、肾、脾、肺标本，采用 免疫吸附试验(ELISA)检测RBD表达水平。结果表明,mRNA-RBD组肌肉和肝脏是主要的RBD表达组织,这是按照以前的观测荧光素酶mRNA LNPs⁴⁵,和一个非常低的水平的RBD表达式也发现在血清和其他组织样本(补充图1)。此外，RBD在肌肉和肝脏组织中的表达在接种后6 h达到高峰，平均浓度为553和437 ng/ml，注射后6 ~ 48 h RBD的表达下降较快(补充图1)。相比之下,没有检测到RBD表达安慰剂老鼠(补充图1)。

单次mRNA-RBD疫苗的免疫原性。用BALB/c小鼠对SARS-CoV-2 mRNA-RBD候选疫苗诱导的免疫应答进行分析。各组小鼠(n = 6)分别用高剂量(15 mu;g, mRNA-RBD-H)或低剂量(2 mu;g, mRNA-RBD-L)或安慰剂注射一次免疫。免疫后4周采集血清样本，采用ELISA法检测SARS-CoV-2 RBD特异性IgG及IgG亚型。结果，高剂量免疫小鼠RBDspecific IgG的平均终点滴度上升的高度gt;10⁵，显著高于低剂量免疫小鼠(图2a)。此外，两种剂量均可诱导IgG2a和IgG1亚类RBD特异性抗体，提示Th1/Th2反应平衡(补充图2)。

使用两种独立的体外试验测定接种小鼠血清中的抗SARS-CoV-2中和抗体:假病毒中和试验和活SARS-CoV-2中和试验。假病毒中和试验显示，接受低剂量(平均值193)的小鼠血清NT90(90%中和效价)显著低于接受高剂量(平均值727)的小鼠(图2b)。活的SARSCoV-2中和试验表明，除了一只接种低剂量的小鼠外，所有接种的小鼠都产生了可检测到的中和抗体，高剂量组的平均NT50(50%中和滴度)值接近920，分别比低剂量组和人类恢复期患者血清组高8.5倍和2.3倍(图2c)。因此，在接下来的研究中，我们选择了高剂量免疫小鼠。

接下来，我们研究了SARS-CoV-2 mRNA-RBD诱导的抗体是否能与SARS-CoV和MERS-CoV发生交叉反应或交叉中和。基于elisa的结合试验表明，免疫后4周BALB/c小鼠的接种血清对SARS-CoV-2 RBD表现出很强的结合能力，而它们对SARS-CoV RBD的亲和力显著降低，对MERS-CoV RBD的交叉反应(如果有的话)也很小(补充图3a-c)。伪病毒交叉中和表明，无论是对伪型SARS-CoV还是对MERS-CoV，均未观察到可检测到的交叉中和活性，与安慰剂的结果相似(补充图3d)。因此，这些结果表明，尽管存在由SARS-CoV-2 mRNA RBD诱导的一些交叉反应抗体，但它们可能无法阻止由SARS-CoV-S蛋白介导的宿主细胞进入。

通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)检测mRNA-RBD诱导的细胞免疫反应。单次高剂量免疫后4周采集C57BL/6小鼠脾脏。在接种疫苗的小鼠中有效地诱导出RBD特异性IgG和中和性抗体(图2d, e)。在体外用RBD肽库再次刺激后，分离并评估脾细胞分泌细胞因子的能力。ELISPOT试验表明，mRNA-rbimmune小鼠分泌gamma;干扰素(IFNgamma;)的T细胞明显多于安慰剂免疫小鼠(图2f)。此外，基于mRNA-RBD免疫小鼠脾细胞产生细胞内IFNgamma;的基础上，检测了SARS-CoV-2 RBD特异性CD4 和CD8 T细胞介导的免疫应答(图2g, h)。因此，mRNA RBD除了体液免疫反应外，还能诱导针对SARS-CoV-2 RBD抗原的实质性T细胞反应。

据报道，感染或接种疫苗引起的病毒结合但非中和性的抗体可能引起ADE效应^46-50。因此，我们也比较了中和抗体和结合抗体比例的差异在启动和加强免疫程序。BALB/c小鼠(n = 5)通过i.m.途径分别注射1次(prime组)或2次(boost组，4周内)mRNA-RBD 15 mu;g或安慰剂，并在首次注射后8周采集血清，检测RBD特异性和NAb滴度。结果显示，与初始接种相比，boost注射将结合抗体和NAb滴度

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