用于降低皮肤光敏性的多模态成像引导肿瘤光动力治疗的中空生物矿化碳酸钙-聚多巴胺纳米粒的合成

摘要：开发可激活的纳米平台，在降低副作用的同时提高诊断和治疗性能，对精准癌症医学极具吸引力。本文利用气体扩散程序开发了一锅、多巴胺介导的生物矿化方法，制备了碳酸钙-聚多巴胺(CaCO₃-PDA)杂化中空纳米颗粒作为多功能治疗诊断学纳米平台。因为这类纳米粒对pH的敏感性高，在弱酸性环境下降解快，因此在pH降低的情况下，被PDA淬灭的载药光敏剂二氢卟酚e6 (Ce6)的光活性在肿瘤内增加，表现为恢复的荧光和增强的单线态氧生成。此外，由于金属离子与PDA之间具有强亲和力，该纳米粒可以与各种类型的金属离子结合，赋予它们多模态成像能力。通过利用pH响应多功能纳米载体，可以在多模态成像的精确引导下实现有效的体内抗肿瘤光动力治疗(PDT)。有趣的是，在正常生理pH下，我们的纳米颗粒被淬灭，对正常组织表现出更低的光毒性，从而有效地减少PDT过程中的皮肤损伤。因此，本文研究提出了一种独特类型的生物矿化治疗性纳米颗粒，其具有固有的生物相容性、多模态成像功能、高抗肿瘤PDT疗效和低皮肤光毒性。

引言

迄今为止，具有集成诊断和治疗功能的多功能纳米平台得到了广泛的探索，目标是具有高度特异性和有效性的精准癌症纳米医学^[1]。近年来，各种可激活的纳米平台，在到达肿瘤前可以从“沉默状态”切换到肿瘤内的“激活状态”，以响应外源刺激(例如，光、温度和超声波)和/或内源刺激(pH值、氧化还原梯度和酶浓度的变化)而受到极大关注^[2-7]。与常规无响应纳米平台相比，可激活纳米平台不仅可以在所需的时间和位置（如仅在病灶内）精确进行治疗而且可以最大限度地减少对正常组织的副作用。因此，开发具有优异生物相容性的可激活纳米平台是非常有意义的，特别是对于癌症纳米医学。光动力疗法(PDT)已成为一种有效的非侵入性治疗方法，其中光敏剂(PS)在光照射下能够将周围的分子氧转变为细胞毒性单线态氧(SO)和活性氧(ROS)，用于有效治疗癌症或其他疾病^[8-10]。然而，常规PDT制剂的肿瘤选择性较差，尤其是在皮肤蓄积方面，光暴露PDT过程中可导致皮肤和其他健康组织严重损伤^[11,12]。因此，为了降低PDT的光毒性同时维持其治疗效果，在正常组织中无活性但通过外源性刺激或肿瘤相关内源性刺激后在肿瘤内变得有活性的可激活PDT药物将相当有研究价值^[3]。最近，包括我们在内的几个不同的研究小组报道了构建近红外(NIR)光激活纳米制剂，用于具有高效皮肤保护的选择性癌症PDT。这些体系通过荧光共振能量转移(FRET)，负载PS的PDT效应被着色的近红外染料分子阻断，并在近红外光照射诱导近红外染料光漂白后恢复，实现了近红外可控的选择性癌症PDT^[13,14]。然而，这些方法仍然有一定的局限性，因为这些可激活PDT纳米系统是由激光外部控制的，而不是肿瘤的内部特征，不能精确区分肿瘤和正常组织。因此，设计可被肿瘤特异性内源性刺激激活的可激活PDT纳米系统将对下一代癌症PDT非常有意义。

仿生和矿化材料，如真黑色素样聚多巴胺(PDA) ^[15-19]，碳酸钙(CaCO₃)^[20,21]，和磷酸钙^[22,23]，由于其优异的生物相容性成为有吸引力的生物应用候选材料^[24,25]。在此，我们报道了一种制备生物可降解和生物相容性CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的简单方法，并将其作为多功能分子负载纳米平台，用于具有高效皮肤光保护的成像引导癌症PDT（图 1）。我们开发了一种多巴胺介导的生物矿化方法，该方法使用一锅气体扩散过程来合成杂化CaCO₃-PDA中空纳米粒子。经聚乙二醇(PEG)修饰后，CaCO₃minus;PDAminus;聚乙二醇（CaCO₃minus;PDAminus;PEG）中空纳米颗粒获得了很好的生理稳定性，并在弱酸性环境下表现出pH依赖性降解。由此可见，负载的二氢卟吩e6 (Ce6)是一种有效的光敏剂，在中性pH下被PDA的强吸收淬灭，在弱酸性肿瘤微环境下，其光活性可以被恢复的荧光和增强的单线态氧激活。此外，这些中空纳米颗粒可以与不同类型的金属离子（如Fe³ 、Zn² 、Mn² 和Co² ）结合，产生具有多模式成像功能的纳米杂化材料。通过多种成像方式发现，Ce6@CaCO₃minus;PDAminus;PEG在静脉给药后可以在肿瘤中高效蓄积，通过PDT产生巨大的抗癌作用。此外，这些纳米颗粒可以显著抑制PDT过程中的皮肤光毒性。因此，这些具有生物降解性、pH响应的PDT效应、多模式成像功能和最低皮肤光毒性的Ce6@CaCO₃minus;PDAminus;PEG纳米颗粒有希望用于下一代PDT。

图 1.Ce6@CaCO₃minus;PDAminus;PEG纳米颗粒作为肿瘤酸性pH可激活纳米平台的示意图，用于多模式成像引导的癌症PDT，降低皮肤光毒性。

结果和讨论

我们首次通过气体扩散步骤开发了一种简单的一锅法，制备了有机-无机杂化CaCO₃-PDA纳米颗粒。如图2a所示，在封闭的小室中，NH₄HCO₃自然分解产生的CO₂和NH₃气体会不断扩散到含有Ca² 和多巴胺的乙醇溶液中，同时提供CO₃^2-源和碱性环境触发CaCO₃的形成^[26]。有趣的是，引入的多巴胺可以加速CaCO₃的生长，CaCO₃与多巴胺氧化的PDA一起会形成CaCO₃-PDA杂化纳米颗粒^[27]。值得注意的是，纳米颗粒形成时间从无多巴胺形成的裸CaCO₃纳米颗粒的72h缩短到有多巴胺形成的CaCO₃-PDA纳米颗粒的24h。

通过简单地调整多巴胺和氯化钙的投料比，可以精确地调控所制备的CaCO₃-PDA纳米颗粒的形态（CaCl₂；图2b）。通过透射电子显微镜(TEM)观察显示，与具有光滑表面的固体球形形态的裸露CaCO₃不同，所获得的CaCO₃-PDA显示出从具有粗糙表面的固体纳米球(以1∶150的多巴胺/氯化钙质量进料比制备)到增加多巴胺含量的中空纳米颗粒的逐渐形态演变。

由于以多巴胺/氯化钙=2:150的质量进料比制备的CaCO₃-PDA纳米颗粒具有均匀且明确的中空结构，因此选择其用于进一步的实验。TEM结果显示CaCO₃-PDA纳米颗粒具有介孔结构，其平均粒径为168nm，壳厚为44nm（图2c）（图2c内置图）。根据比表面积(BET)测量结果，计算孔径和比表面积分别为6.2nm和252 m²g^-1（图S1）。此外，通过基于高角度环形暗场扫描TEM(HAADF-STEM)的元素图谱分析，发现N、O和Ca在CaCO₃minus;PDA纳米颗粒中均匀分布（图2d,e）。通过一锅反应可以很容易地合成出克级的高质量的CaCO₃-PDA纳米颗粒（图2f-h）。

图 2 CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的制备和表征。(a)示意图显示CaCO₃-PDAminus;PEG中空纳米颗粒的合成。(b)在多巴胺和CaCl₂不同投料比例下制备的CaCO₃和CaCO₃-PDA纳米颗粒的典型TEM图像。(c)用多巴胺：CaCl₂的投料比为2：150制备的CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的代表性TEM图像。(d) 暗场中CaCO₃-PDA中空纳米粒子的STEM绘图分析，显示氮、氧和钙在合成的CaCO₃-PDA中空纳米粒子中的分布。(e)CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的EDX光谱。插图显示了所制备的CaCO₃-PDA中空纳米颗粒中C、N、O和Ca含量表。(f)用于大规模合成CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的1000 mL烧杯的数字图像。(g)显示CaCO₃-PDA中空纳米颗粒克级生产的图像。(h)克级制备的CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的典型TEM图像。

然后，研究了CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的详细形成机制。在CaCO₃-PDA的制备过程中发现，生长液迅速由无色变为蓝色，这可归因于Ca² 与聚多巴胺的配位（图S2）。研究发现氧是CaCO₃-PDA生长过程中触发多巴胺聚合的关键因素。在氧存在下制备的CaCO₃minus;PDA纳米颗粒显示出明确的中空结构，而在无氧条件下制备时未观察到明确的纳米颗粒（图3a）。在相应的条件下，对于在没有多巴胺的情况下制备的裸CaCO₃纳米颗粒，氧对制作的CaCO₃纳米结构的形态学没有明显的影响。这些结果表明，多巴胺的聚合是介导CaCO₃-PDA中空纳米粒子生长的关键因素。虽然聚合的多巴胺将促进CaCO₃的生长，但在没有氧介导的聚合的情况下，Ca² 与多巴胺的配位将中断CaCO₃纳米结构的形成。

此外，空心碳酸钙的形成与时间有关——通过对不同时间间隔从生长溶液中收集的纳米颗粒进行TEM分析，研究PDA纳米颗粒。在反应开始后2h，观察到平均尺寸约为40nm的不规则固体纳米颗粒（图3b），通过热重分析确定其PDA含量约为47%（TGA；图3c）。6h后，观察到具有小实心核的中空纳米颗粒(图3b)。24h后，纳米粒子已经生长成轮廓分明的中空纳米粒子。而且，CaCO₃-PDA纳米颗粒的大小从2h的plusmn;40nm逐渐增加到该反应开始后6h的plusmn;80 nm和24h的plusmn;170 nm（图S3），而它们相应的PDA含量在三个各自的时间点从47%逐渐下降到21%和7.2%（图3c）。

因此，基于这些观察结果，提出CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的形成机制遵循三步过程（图3d）。首先，多巴胺在氧存在下发生快速的氧化聚合，生成与Ca² 协调形成Ca-PDA配位纳米杂化物的PDA。然后，由NH₄HCO₃分解的CO₂逐渐溶解到CaCl₂/多巴胺溶液中，以CO3^2-的形式与Ca² 相互作用，导致CaCO₃在Ca-PDA核表面沉积。由于Ca² 和CO3^2-之间的亲和力强于多巴胺和Ca² 的酚羟基之间的，固体核心中的Ca² 逐渐向外扩散与CO3^2-协调，通过由内向外的成熟过程导致核心的溶解和CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的形成^[28]。与之前开发的制造中空纳米结构的胶束模板方法相比，这种一锅法制备的CaCO₃中空纳米颗粒简单可靠^[29,30]。

图 3.CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的形成机制研究。(a) 在有氧和无氧条件下制备的CaCO₃-PDA中空纳米颗粒和裸CaCO₃的TEM图像。(b) 在2、6、24h反应时间拍摄的CaCO₃-PDA中空纳米颗粒时间依赖性形态演变的TEM图像(c) 不同反应时间收集的CaCO₃和CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的TGA曲线。(d)提出了CaCO₃-PDA中空纳米颗粒的时间依赖性生长机制。

接下来，对纳米颗粒进行表面修饰。根据之前的工作，用由1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（钠盐；DOPA）、1，2-二十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和胆固醇组成的脂质双层修饰制备的CaCO₃-PDA纳米颗粒，通过两步法进一步包被PEG偶联的1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)（图4a）^[31]。在这种方法中，DOPA的磷酸盐头部与CaCOlt;

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