毕赤酵母中重组人神经突蛋白的表达、纯化及其体外神经生物学活性的部分分析

Yunhua Zhang¹ Shujun Zhang¹ Lingling Xian¹ Juan Tang¹

Jingling Zhu¹ Lijuan Cui¹ Shanman Li² Lei Yang³ Jin Huang¹

摘要：神经突蛋白(也称为候选可塑性基因15(cpg15))是一种神经营养因子，最近在一个旨在识别与活性依赖性突触可塑性相关的基因的筛选中被发现。神经突蛋白在两种神经发育中扮演多种角色^[1-3]和突触可塑性^[4-6]。在这项研究中，为了产生生物活性的、可溶的重组人神经蛋白，将一部分RN1克隆到毕赤酵母表达载体pPC9k中。然后将重组载体转化到甲基营养酵母菌株巴斯德毕赤酵母GS115中，并利用摇瓶法和His-Tag纯化策略表达和纯化神经突蛋白。所得蛋白质的分子量约为11kDa，随后的功能分析表明纯化的神经突蛋白促进了神经突来自胚胎鸡背根神经节的生长，同时也延长了这些神经节的存活时间，以及来自PC12细胞的生长。这些发现表明神经突蛋白在体外有效表达，这种蛋白可能在刺激背根神经节和PC12细胞的神经突生长中发挥作用。这项研究为大规模生产生物活性神经轴突素提供了新的途径，这将有助于进一步研究这种蛋白质的生物学功能。

关键词： 背根神经节； 背根神经节； 神经突素； PC12细胞； 毕赤酵母； 提纯

引 言

神经营养因子家族的成员之一-人神经营养蛋白(也称为鼻念珠菌可塑性基因15(cpg15))，由NRN1编码。该编码序列位于第6号染色体上的6p24 - p25区间内，该区域包含总共2072个碱基对(BP)，包括426 BP的open reading frame (ORF)。成熟神经突蛋白是由142个氨基酸组成的小糖蛋白。氨基酸1至27编码信号肽，残基116至142编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定点。神经突蛋白以两种形式存在:一种是通过GPI结构域锚定在细胞膜上的膜蛋白，另一种是通过切割信号肽产生的可溶性蛋白。先前的研究表明，神经突触素参与神经元突触传递^[7]，调节突触可塑性，抑制细胞退化和凋亡^[8]，刺激神经元迁移^[9-10]，并促进视觉皮层神经元的发育和成熟^[1-3]。因此，该蛋白可用于治疗神经系统疾病和损伤^[11]。然而，还需要进一步的研究来表征神经突蛋白在发育和神经损伤修复过程中的作用以及作为凋亡抑制剂的作用。对于研究这个分子的加工和生物学功能来说，纯神经突蛋白的可用性是必不可少的。以前，少量重组人神经轴突素是通过在永生化细胞系中瞬时表达产生的，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞^[12]或COS-7细胞^[13]。此外，神经突素最近上市；然而，因为这种蛋白质产物是使用大肠杆菌表达系统产生的，所以蛋白质可能不能正确折叠^[14]。在本研究中，我们利用毕赤酵母真核表达系统，建立了一种更高效、更经济的方法来生产大量可溶性功能性神经轴突素。这种方法将有助于进一步研究神经轴突素促进神经损伤修复的机制，以及分析这种蛋白质的结构-功能关系和潜在的临床应用。

材料和方法

菌株、细胞和质粒

巴斯德毕赤酵母菌株GS115购自Invitrogen。当然，这种菌株也可以从美国典型组织培养物保藏中心购买。PC12细胞购自中国科学院类型培养物保藏中心；它也可以在ATCC 上买到。白色Legahorn鸡E8胚胎购自中国石河子种禽场。如前所述，背根神经节(DRGs)从腰椎区域分离出来，并通过解剖显微镜下的机械处理收集^[15]。所有协议都是由希什河大学医学学院的机构动物护理和使用委员会批准的，符合《实验动物护理和使用指南》。为了在巴斯德毕赤酵母中表达，使用了毕赤酵母表达载体pPIC9K。之所以选择这个载体，是因为它允许感兴趣的序列多拷贝整合到毕赤酵母基因组中，并在一元醇氧化酶1 (AOX1)启动子序列下游编码一个多克隆位点，以允许候选序列的甲醇诱导表达。此外，该载体能够将alpha;因子分泌信号序列N末端融合到目的序列中，以允许将蛋白质输出到培养基中。最后，载体包含用于选择的HIS4以及氨苄青霉素和卡那霉素抗性盒(图1)。本研究中使用的所有试剂均从标准商业来源获得，均为试剂级。

图1.重组pPIC9K -神经突蛋白载体的设计

神经突蛋白表达载体的构建

为了产生神经突素表达载体，使用哺乳动物表达载体pc DNA 3.1-His-神经突素作为模板，通过PCR扩增了含有神经突素(核苷酸733-999)的可溶性部分的5rsquo;-His-标记序列，该序列缺少信号肽和神经突素结构域。pc DNA 3.1-His神经突蛋白的构建由上海桑根生物工程技术服务有限公司进行。合成神经突蛋白片段(核苷酸652-1077)包括位于5rsquo;末端的EcoR I限制性位点和位于3rsquo;末端的Bam HI限制性位点。然后将完整的合成DNA片段克隆到载体pc DNA 3.1 (-)/myc-His A的EcoR I-Bam HI位点。根据已发表的NRN1核苷酸序列设计PCR引物: 正向：5rsquo;-CGGAATTCCATCATCATCATCATCATGCGGGCAAGTGCGATGCGGTC-3rsquo;;反向：5rsquo;-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCACCCGTTGCCGCTGCCGCAGAGTT-3rsquo;。寡核苷酸由上海桑根生物工程技术服务有限公司合成，设计包括EcoR I (正向)和Not I (反向)限制性酶消化位点，以便能够克隆到pPIC9K的多个克隆位点。PCR使用以下参数进行: 95°C持续5min，随后30个循环94°C持续30s，64°C持续30s，72°C持续1 min，最后72°C持续10 min。所得扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，从凝胶中切下正确大小的条带，并用QAquick凝胶提取试剂盒提取DNA。纯化的DNA是图1重组pPIC9k -神经突蛋白载体的设计用EcoR I和Not I进行限制性消化，然后克隆到线性化的pPIC9K中，用相同的酶消化。所得pPIC9K - His-神经突蛋白重组质粒的序列通过DNA测序得到验证，该测序是在北京基因组研究所进行。

巴斯德毕赤酵母的转化与筛选

大约5-10mu;g质粒构建体通过在37℃下用Sac I限制性酶处理3小时而线性化。消化的DNA使用Qiagen PCR纯化试剂盒清洗，并通过使用基因脉冲器电穿孔系统电穿孔引入巴斯德毕赤酵母菌株GS115。组氨酸利用加上(His )转化体是由缺乏组氨酸的超高产葡萄糖(RDB)板选择的。然后在补充有3mg/ml G418的酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)平板上划线菌落。利用甲醇的表型遗传霉素抗性菌落的特征是在最小甲醇(MM)和最小葡萄糖(MD)平板上一式两份划线。甲醇利用阳性(Mut ) P . Pastorestrian菌株是从Hemmings平板上采集的，使用制造商推荐的AOX引物和上述NRN1特异性引物，通过PCR验证了神经突蛋白编码序列与这些菌株基因组的整合。整合保留阳性转化体用于进一步分析，同时丢弃缺少插入物的转化体。

巴斯德毕赤酵母重组蛋白的表达与纯化

为了实现高水平的蛋白质表达，优化了以下培养条件:培养物的甲醇(诱导剂)浓度(0.5、1、1.5和2%)和诱导时间(24、48、72和96h)。为了确定最佳条件，如前所述，用12%十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE分析从在这些条件下加工的培养物中收获的培养基中的神经突蛋白表达水平，然后进行考马斯染色^[14]。然后在振荡的培养瓶中，在最佳表达条件下培养表达神经突素的转化体(培养体积1L，30℃下220 rpm)，通过离心(19000times;g，4℃下20分钟)从所得培养基中收集上清液。此后，上清液用(NH₄)₂SO₄调节至饱和度为65 %，并如前所述在4℃搅拌12小时^[16]。通过离心收集沉淀的蛋白质(19000times;g，在4℃下30分钟)并重新溶解在层析溶液中(0.5M NaCl、20 mM 磷酸钠、1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)、1 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)和5 mM 咪唑，pH7.4)。亲和层析使用His Trap FF粗预填充柱收集融合蛋白。纯化前，用起始缓冲液(0.5M NaCl、20 mM磷酸钠和5 mM咪唑，pH 7.4)平衡色谱柱。随后，含有蛋白质的层析溶液通过一张滤纸过滤并装载到柱上。然后使用起始缓冲液洗涤柱，层析介质中的蛋白质用洗脱缓冲液(0.5M NaCl、20mM磷酸钠和200 mM咪唑，pH7.4)以1 mL/min的速率洗脱，检测波长为280nm，并通过保留吸收峰而收集。用Amicon Ultra-15过滤装置浓缩稀释的蛋白质样品，并透析以降低盐浓度。纯化的样品通过SDS-PAGE、Western印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析，然后冷冻干燥用于后续生物分析。

蛋白质印迹和免疫缺陷病毒I - TOF分析纯化的神经轴突素

用12% SDS-PAGE分离蛋白质样品和蛋白质分子量标记物(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的发酵罐)。然后将凝胶在22V下电转移(Trans-Blot SD细胞和系统，Bio-Rad)到硝酸纤维素膜上45分钟。将膜在5%封闭缓冲液(用0.02%吐温20 [PBS/T在1times;PBS [pH 7.4中的印迹级封闭剂脱脂奶粉)中振荡封闭2h，然后在室温下用1times;PBS/T振荡洗涤两次。使用小鼠抗His单克隆抗体(1:1000；西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)和山羊抗鼠IgG-HRP (1: 15000；Sigma-Aldrich)用5%脱脂奶粉稀释在1times;PBS/T中。然后使用过氧化物酶底物检测免疫复合物。如前所述^[17]生物永(北京)科技有限公司也通过MALDI-TOF质谱分析纯化的蛋白质样品。

神经突素对DRGs的影响

孵育8天后，从受精卵中收获DRGs，并将其置于预先涂有聚L -赖氨酸的96孔板(2-3 DRGs /孔)中。神经节在含有1.5% 胎牛血清(Gibco)的200mu;L /孔RPMI 1640 (美国纽约州大岛市Gibco)中培养，并分为三个实验组:阴性对照组、神经生长因子(NGF)阳性组和神经突素治疗组。阴性对照组进一步分为空白对照组、6times;His蛋白对照组和牛血清白蛋白(BSA)对照组。当空白对照群体中没有添加蛋白质时，将20mu;g/mL(最终浓度)BSA添加到BSA对照细胞中，并将20mu;g/mL(最终浓度)6times;His蛋白质添加到6times;His蛋白质对照细胞中。NGF (美国新泽西州落基山的PeProtech)以1mu;g/mL的最终浓度加入NGF阳性组。最后，将纯化的神经素分别以8、16和24mu;g/mL的浓度加入神经素治疗组。然后在37℃培养神经节2-4天，观察并比较各组的神经纤维生长情况。此外，在连续培养期间，通过观察DRG分裂的开始时间，研究神经突素对DRG存活时间的影响。

神经突素对PC12细胞的影响

PC12细胞在含有1.5%胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640(Gibco)的125mu;L/孔中于96孔板中培养。PC12细胞生长到对数生长期，用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco)消化，以1000 rpm离心1分钟，再悬浮在含有1.5%胎牛血清的RPMI 1640中，然后以6times;103/mL的细胞密度分装到96孔板中。该实验包括三个细胞群:阴性对照组、NGF阳性组和神经突素治疗组。阴性对照组分为PBS对照组和6times;His蛋白对照组，PBS对照组用25mu;L PBS处理，His蛋白对照组用6times;His蛋白处理，最终浓度为20mu;g/mL。同时，NGF以50 ng/mL的最终浓度添加到阳性组的细胞中，神经突蛋白以1mu;g/mL的最终浓度添加到神经突蛋白治疗组中。治疗后第3天观察PC12细胞的形态学变化。

神经突起生长试验

对于神经突起生长测量，每个实验分析了来自每组的25个DRG，并且在单个DRG中测量了50个最长的神经突起树^[18]。使用NIH ImageJ软件和NeoNJ插件对DRGs进行分析。从躯体周长到神经突顶端的距离为通过追踪树木来测量。所有数据都表示为平均值的标准误差(SE)。通过测量细胞的总长度和单个细胞中最长神经突起的长度来评估PC12细胞神经突起的生长。使用奥林巴斯显微镜(奥林巴斯，东京，日本)通过共焦显微镜观察活细胞，并且每块板捕获10幅随机图像。如果一个细胞包含至少一个比细胞体更长的神经元过程，它就被认为是神经突起。分析每个图像中的所有细胞，每个组织培养板评估超过100个细胞。对于每张图像，神经突起都是用NIH ImageJ软件和NeoNJ插件跟踪和测量的。实验至少重复了三次。测定每次治疗的平均值(SE)^[19]。

结 果

利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达神经轴突素

通过SDS-PAGE，随后考马斯蓝染色，分析经历不同诱导时间和甲醇浓度的发酵培养基中神经突蛋白的表达(图2)。尽

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