洋甘菊中形成三喹烷的倍半萜合酶MrTPS2反应机理的理论和实验分析外文翻译资料

洋甘菊中形成三喹烷的倍半萜合酶MrTPS2反应机理的理论和实验分析

Young J. Dong,Sandra Schism, Angelina C. Wang, Stefan Arms,

Jonathan Henderson, Lillian Cu, Phobias G. Keller, and Dean J. Antilles

摘要: 萜类化合物合成酶作为萜烯生物合成的关键酶，多年来一直受到化学家和生物学家的关注。它们的碳阳离子反应机制决定了自然界中萜烯结构的多样性。这些机制可以通过经典的生化方法和计算分析来研究，在本研究中，我们结合量子化学计算和氘标记实验来阐明从洋甘菊形成倍半萜合成酶的反应机制。我们的研究结果表明，法呢基二磷酸对三喹啉的反应是通过石竹基和前交联阳离子进行，并涉及到一个稳定的(-)-(E)- beta;-石竹烯中间体的质子化反应。发现一个酪氨酸残基似乎参与了质子转移过程。

关 键 词:生物合成; 碳化合物; 密度泛函计算; 天然产物; 反应机理; 萜类化合物

介绍

三喹烷型倍半萜类化合物^[1]几十年来一直是合成^[2]和生物有机化学家感兴趣的对象^[3,4]，毫无疑问是因为它们拥挤、立体密集、多环结构。在此，我们研究了在自然界中可能产生这种化合物的化学机制，如异omega;烯、硅菲烯和Mod - Hephene。两个非常不同的机制(方案1;考虑了法呢基焦磷酸(FPP)原子序号。其中之一最初是由Boltzmann和Japonica提出的(路径1，红色;最初的提议实际上包含了一个非古典的离子，从而避免D和E)^[4],而另一个由Morton (路径 2，深蓝色)提出。

前者^[5]涉及到一个环芳烃阳离子(C)的中间体，该阳离子(C)被转化为一个正二芳基阳离子(F)，然后转化为具有三喹烷骨架的碳正离子。后者涉及不同的环闭合和重排事件，5/8个双环碳基(L/M)作为关键中间体。我们描述了量子化学计算的能量活力的机制路径(和绕道;方案1，紫色，浅蓝色)^[6],以及氘标记实验从甘菊(MrTPS2)中分离出的异omega;酮进行氘标记实验。Wang和Antilles，以及Albuquerque和Crevasse^[7]使用密度泛函理论(DFT)计算方法对Boltzmann机制的^[8-10]部分进行了研究，但这些研究在此有很大的扩展。在以下理论和实验结果的基础上，我们提出，虽然这两种机制的建议都是积极可行的，但Bohl - Mann - Jakupovic机制是MrTPS2促进反应最有可能的机制。

方案1. 异omega;烯和相关倍半萜类化合物的拟议途径(法呢基二磷酸酯( FPP )原子编号贯穿始终)。

结果与讨论

可能机制的理论分析:预测路径1(参见实验部分^[11-17])涉及烯丙基与法呢基阳离子C10=C11pi;键之间的初始[_pi;2_{S pi;}2_S]环加成反应(A1/A2→C1;计算几何显示在图1中)，具有低预测屏障 (lt;5千卡mol ^-1)。这种反应预计是协调一致的，因此在轨道- al对称的基础上是禁止的^[18],但环加成的反应过程预计是非常不同步的^[19],涉及顺序C-C键形成，但是在反应坐标的任何地方都没有中间和强烈的环或双环重叠^[20]。 如图1所示，对于farne - syl阳离子的两个构象异构体( A1或A2 )中的任一个，可以发生协同但异步的[ 2 2 ]环加成，但这两种途径的过渡态结构在键形成程度上不同，即一个比另一个晚。应该注意的是A2→C1过程难以建立，我们的计算也与中间B1的非稳态形成一致，可能是通过后过渡状态(这里，是TS_{A2-B1 /C1})分叉^[21]。 在此过程中形成的若干个石竹烯阳离子的构象(C1, C2, C3)可以以相对较低的壁垒相互转化^[22]。 一个协调但不同步的扩环烷基转移，然后pi;-阳离子环化反应(C3→E)可以发生在到达预阳离子F的途中发生，这个碳正离子可以通过一系列低阻隔性的烷基和氢化物转移转化为异阳离子I1(图2)。

路径2.涉及各种环化、烷基位移和氢化物位移事件(计算几何在图3和图4中显示)，其中一些再次被预测将被组合成协调但异步的过程，例如L→N, R→Q。

图5总结了沿路径1和2发现的结构的计算能量。净A→I的反应是非常放热，超过40千卡 mol^-1、如预期的那样，多个pi;键交换为sigma;键的反应。这两种途径的总体障碍都很低，这表明两者都是积极可行的。这两种方法都涉及大量能下降的步骤:C3→E代表路径1和L→N代表路径2;对于这两种情况，一个大环被挤压成两个较小的环，一个新的sigma;键形成时，而环丁烷环的应变也是前者的。这两种途径还包括在相对较深的势能井中沿其反应坐标的早期部分形成中间产物:C1，接着是TS_C3-E是路径1和J1，后面是TS_k2-k3路径2。注意，从J1中逃脱的势垒比从C1中逃逸大约8千卡mol^-1，这种差异是否足以打破酶促反应的平衡还有待观察，尽管我们的标记实验表明可能如此(见下文)。还需要注意的是，这两种途径都涉及到一些中间产物的形成，这些中间产物可以在它们的最后阶段相互转化，这表明异omega;酮的形成，可能是由一种酶强制的去质子事件控制的^{(20 b, 23)}。

图1.路径1初始部分所涉及的中间体和过渡态结构的计算几何图形(B3LYP/6-31 G(d,p))和能量(标准文本中的B3LYP，括号中的PW1PW91，括号中的MPWB1K(方案1);这个路径的其余部分如图2所示^[8]。这个构象变化的转换状态结构没有被定位。

图2.在路径1(方案1)的最后部分中涉及的中间产物和过渡态结构的计算几何图形(B3LYP/6-31 G(d,p))和能量(B3LYP在正常文本中，mPW1PW91在括号中，MPWB1K在括号中)，分别由G、I1、T和V的去质子导致了硅啡烷、异omega;烯、地环烯和modhephene。另一个甲基在C11 (H)处的移动预计具有更高的屏障（见支持信息)。

图3.路径2(方案1)初始部分所涉及的中间体和过渡态结构的几何计算(B3LYP/6-31 G (d,p))和能量(标准文本中的B3LYP，括号中的mPW1PW91，括号中的MPWB1K);这个路径的其余部分如图4所示。支持信息中描述了一种涉及到A、B和J的不同构象的阳离子J(具有略高的总体壁垒)的替代路径。

图4.路径2(方案1)最后部分涉及的中间产物和过渡态结构的计算几何图形(B3LYP/6-31 G (d,p))和能量(标准文本中的B3LYP，括号中的mPW1PW91，括号中的MPWB1K)。

MrTPS2反应机制的实验分析:我们的计算分析显示，预测的形成ɑ-异omega;酮的两种多环化途径在能量都是可行的，尽管可以支持路径1(见上文)。为了确定MrTPS2实际上促进了哪一种途径，我们使用重组蛋白和在不同位置携带氘原子的底物进行酶分析，比如[2-²H]-(2E,6E)-FP和 [6-²H]-(2E,6E)-FPP(图6)。采用GC-MS法测定了主要酶产物ɑ-异omega;酮的分子离子(m/ z 204)和主片段离子(m/ z 162)的质量位移，并作为路径1和路径2(方案1)的氢化物位移的指标。主要的片段离子可能是一个双环共轭二烯([M - C3H6] )，这可能是由于从三环ɑ-异omega;酮结构中损失了一个三碳单元(C4, C5和C6)而产生的(图6 A)。

[2-²H]-(2E,6E)-FP和 [6-²H]-(2E,6E)-FPP中得到的ɑ-异omega;酮的分子离子相对于未标记的产物都被一个相对原子质量单位(amu)移位，证实了这些分子中保留了氘原子(图6 B和C)。然而,大规模转移的主要碎片离子只是观察到产品从[6-²H]-(2E,6E)-FPP(m / z 163)。这可以用路径1从C2到C7的1,3-氢化物位移来解释。这一事实的主要碎片离子ɑ-异omega;酮获得[6-²H]-(2E,6E)-FPP没有标记(m / z 162)也符合路径1的氢原子在C6(或氘原子)是不能转移到另一个碳原子,因此丢失3个碳单位一起在碎片。与路径1相反，路径2中提出的1,2-氢化物从C6转移到C7，会导致从底物[6-²H]-(2E,6E)-FPP中形成标记的主片段离子[6-²H]-(2E,6E)-FPP。

为了进一步证实反应沿着路径1进行，我们测试了底物[2,4,4,15,15,15-2H6]-(2E,6E)-FPP(图6 D)，它含有6个氘原子。令人惊讶的是，MRTPS 2的分子离子产生了】alpha; -异omega;烯、beta;-异omega;烯、silphinene、modephene和 (E)-beta;-石竹烯显示可量标记模式,表明在反应周期中分别损失了一个,两个或三个氘原子 (表1)。最近，Nakano和同事报告了一种细菌萜烯合成酶(Cocoa)，该酶通过中性中间体( )-(E)-beta;-石竹烯催化了从FPP到( )-caryolan-1-ol的反应。Cocoa的反应机制包括质子对( )-(E)-beta;-石竹烯亚甲基部分的双键进行重复的质子攻击，然后从生成的甲基中去质子^[24。^]由于MrTPS2作为副产物产生(-)-(E)-beta;-石竹烯^[7]可以推测稳定的(-)-(E)-beta;-石竹烯中间体的重复质子化/去质子化循环也可能发生在该酶催化的反应中，解释了观察到的氘原子的丢失。为了验证这个假设，我们在D₂O中使用重组MrTPS2蛋白和未标记底物(2E,6E)-FPP进行酶分析，分析所有酶产物的分子离子簇(m/ z 204 x)的主要峰。在D₂O中，MrTPS2与(E)-beta;-石竹烯和ɑ -蛇麻烯（也称为ɑ -石竹烯)相比，产生的三喹烷的含量明显少于H₂O(图7 A)。这表明质子化/脱质子反应循坏可能会产生等峰效应。此外, D₂O中由未标记FPP形成的三喹烷的质谱显示了一个、两个或三个氘原子的结合，平均比率为26%(m / z 205),33%(m / z 206),和分别为36%(m / z 207)(图7 B)。大约50%的(E)-beta;-石竹烯生产仍无标号(m / z 204)。然而，29%的样品中含有一个氘原子(m/ z205)，21%的样品中含有双重标记(m/ z206)。在相比之下，ɑ-蛇麻烯没有加入氘(m/ z204)。双标记(-)-(E)-beta;-石竹烯的质谱(见支持信息图1)与Nakano及同事发表的( )-[15,15-2H2]-(E)-beta;-石竹烯的质谱一致^[24]，Cocoa表明MrTPS2催化的质子化反应可能发生在的C15位点。

总的说来,这些研究结果表明,催化的反应机制MrTPS2最有可能遵循路径1和涉及重复周期的质子化作用/去质子化的一个中立的(-)-(E)-beta;-石竹烯中间(方案1)。最终异omega;酮的去质子化可以发生在C1或C13，分别产生主产物ɑ-异omega;酮和小产品beta;-异omega;酮。ɑ-蛇麻烯和silphinene的形成可能是由于它们各自的碳阳离子的区质子引起的，而碳阳离子是路径1反应序列的一部分。另一种1,2-烷基转移用于中间氢和产生的螺旋桨形状的三醌碳正离子(V)的脱质子导致副产物modhephene(见上文)。

图5.计算相对能量(mPW1PW91/6-31 G (d,p));在千卡 mol^-1中，沿着路径1(顶部)和路径2(底部)的结构。

表1.在H₂O存在下，由[2,4,4,15,15,15-2H6]-(2E,6E)-FPP组成的MrTPS2产品的标签模式。采用背景校正后的分子离子峰面积(m/ z204 x)进行计算。

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