烟酰胺食物补充剂可减轻γ射线诱导的基因组DNA中无碱基位点：NAD 生物合成的代谢上调外文翻译资料

烟酰胺食物补充剂可减轻gamma;射线诱导的基因组DNA中无碱基位点：NAD 生物合成的代谢上调

原文作者：Vipen Batra ，Binita Kislay

单位：Radiation Biology and Health Sciences Division, Bhabha Atomic Research Centre

摘要:无毒的放射防护药物的研究已经产生了许多潜在的制剂，但是这些化合物大多数都具有一定的毒性。本研究的目的是研究饮食中烟酰胺富集对60Cogamma;射线潜在细胞毒性作用的适应性反应。为了阐明可能的潜在机制，将雄性瑞士小鼠分为对照饮食（CD）和烟酰胺补充饮食（NSD）两组。在CD和NSD饮食方案的6周后，我们将动物暴露于gamma;射线（2、4和6 Gy）下，并调查了下游代谢产物的概况以及参与NAD 生物合成的酶的活性。接受NSD喂养的受辐照小鼠，辐照后长达48小时观察到烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）和烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（NMNAT）的活性增加。随着肝脏NAMPT和NMNAT活性的增加，NSD喂养的辐照动物的NAD 水平得到了补充。但是，用CD喂养的辐照小鼠肝脏中NAMPT和NMNAT介导的NAD 生物合成和ATP水平严重受损。这些研究的另一个主要发现表明，与CD喂养的动物相比，NSD喂养的动物在gamma;射线辐射下，烟酰胺食物补充剂可能会诱导更高和持久的聚（ADP）-核糖聚合酶1（PARP1）和聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）活性。为了调查肝脏DNA损伤，对嘌呤/嘧啶位点（AP位点）的数量和8-羟基-2-脱氧鸟苷残基的水平进行了定量。与NSD喂养的辐照小鼠相比，在CD喂养的辐照动物中观察到肝DNA AP位点和8-oxo-dG水平显著增加，同时caspase-3升高。总之，目前的研究表明，在gamma;射线辐射条件下，烟酰胺食物补充剂可通过长时间激活PARP1和PARG活性来恢复DNA切除修复活性。目前的结果清楚地表明，肝脏NAD 补充可能是减少放射损伤的一种新颖有效的方法。

关键词:gamma;-射线 烟酰胺 新陈代谢 NAD DNA AP位点

1. 引言

通过饮食调节对抗各种形式的作用，包括gamma;辐射作用，已被证明是有效的策略[1]。在所有辐射细胞靶标中，DNA被认为是最关键的分子。烟酰胺，是维生素B3（烟酸）的酰胺形式，是与DNA修复反应有关的代谢途径的底物[2]。仅有少量数据记录了烟酰胺（吡啶-3-甲酰胺）食物补充剂对gamma;射线诱导的DNA损伤的保护作用[3]，[4]，[5]。哺乳动物主要使用烟酰胺作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ）生物合成的前体[6]。多项研究表明，烟酰胺通过充当NAD 的前体，可能会影响DNA中产生的嘌呤和嘧啶游离位点（AP位点/绝对位点）辐射的修复[7]，[8]，[9]。哺乳动物细胞中AP位点的BER(碱基切除修复)依赖性修复引入DNA单链断裂（SSB）作为中间体，进而激活核酶，聚（ADP）-核糖聚合酶1（PARP1）[10]。 PARP1通过利用NAD 形成DNA修复蛋白的聚ADP-核糖（PAR）衍生物来辅助DNA修复过程[11]。由于这种潜在的机制，越来越多地证明了细胞NAD 的状态会改变细胞对gamma;射线辐射的敏感性，从而突出膳食烟酰胺在DNA修复中的可能作用[12]，[13]。烟酰胺通过两种酶（烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）和烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（NMNAT））再循环至NAD [14]。

现有数据清楚地表明，辐射暴露后，PARP1立即与AP部位结合[15]，[16]。早期的研究还表明，PARP1可能通过吸引其他BER蛋白参与AP位点修复过程的协调[17]。当被DNA链断裂激活时，PARP1使用NAD 作为底物在DNA修复蛋白上形成ADP-核糖聚合物[18]。已经发现高水平的DNA链断裂会诱导大量的聚合物形成，同时伴随细胞NAD 水平的降低，从而对BER依赖的AP位点修复产生不利影响[19]，[20]。随之而来的NAD 耗竭可能会抑制ATP的糖酵解生成，进而导致ATP耗竭，最终导致细胞死亡。然而，除了修饰几种DNA修复蛋白外，PARP1还通过聚（ADP-核糖基）化修饰自身，使得PARP1的活性被抑制[21]，[22]。聚ADP核糖（PAR）的体内半衰期少于一分钟[23]。聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）降解PARP1合成的PAR聚合物[24]。因此，PARG通过不断从PARP1中去除抑制性ADP-核糖残基来维持PARP1的活性状态[25]。因此，PARG活性的调节可能影响PARP1介导的AP位点修复[26]。

gamma;射线诱导自由基与DNA反应，对嘌呤和嘧啶碱基造成损害[27]，[28]。在这项研究中，我们集中于DNA代谢物8-hydroxy-2-deoxyguanosine（8-oxo-dG），作为放射敏感性的标志。 Ogg1是负责从DNA中切除8-oxo-dG的主要酶。较早的研究[29]表明，Ogg1与PARP-1的结合在氧化DNA损伤的修复中起着功能性作用。鸟嘌呤由于其低氧化还原电位而成为gamma;-辐射介导的氧化反应的高度敏感目标[29]。而且，8-oxo-dG具有诱变性，因为它能够与胞嘧啶和腺嘌呤形成碱基对[30]。因此，组织中的8-oxo-dG水平是致突变性最强的病变之一，也是基因组DNA中AP位点最丰富的来源[31]。AP位点的修复延迟还可能导致复制诱导的双链断裂（DSB）[32]。因此，减少DNA中的AP位点可能是减少gamma;辐射不良影响的一种方法。

现有证据表明，烟酰胺缺乏可能会损害DNA修复蛋白的ADP-核糖基化，从而导致DNA中AP位点的积累[33]。因此，我们想知道烟酰胺食物补充剂是否具有减轻辐射诱导的AP位点和延迟细胞死亡的潜力，如果有，则该结果是否是由于NAD 生物合成的代谢上调所致。使用烟酰胺作为放射防护剂的新治疗策略的开发很大程度上取决于阐明将这种养分与DNA修复反应联系起来的代谢途径。
2. 材料和方法
2.1 化学品和试剂
ATP，双cin，酪蛋白，1-二硫苏糖醇（DTT），脱氧胆酸，EDTA，（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），Igepal CA-630，二甲基噻唑基二苯基四唑（MTT），烟酰胺，烟酰胺腺嘌呤单核苷酸（NMN），核提取试剂盒，蛋白酶抑制剂混合物，Tris-HCl缓冲液，triton X-100，tween 20和酵母醇脱氢酶购自Sigma-Aldrich Chemical Co（美国密苏里州圣路易斯）。用Milli-Q净水系统（密西根州贝德福德市，Millipore）纯化去离子水，所有其他化学药品/试剂均购自知名制造商，且均为分析纯。
2.2 动物维护和饲养
对从Bhabha Atomic的部门动物收容所获得的雄性瑞士小鼠维持正常对照饮食（CD）和基于AIN-93 M公式的烟酰胺补充饮食（NSD）（6周），[34]，建议啮齿动物的蛋白质含量为14％（w / w）（表1）。在整个研究过程中，使小鼠自由进食和饮水。每个笼子中圈养三只小鼠，室温恒定为23plusmn;1°C，光暗周期为12 h。与以NSD饲养的动物相比，以CD喂养的动物没有发现总食物消耗和体重有显着变化。小鼠的平均初始体重为22.7plusmn;1.4g。
表1.正常对照饮食（NCD）和烟酰胺补充饮食（NSD）的组成。

酪蛋白由Central Drug House（P）Ltd.（印度新德里）提供，玉米淀粉和糊精玉米淀粉（饲料级）由Vijaya Enterprises（印度孟买）提供，蔗糖由Sisco研究实验室（印度孟买）提供，大豆油由 Bharat Foods合作社有限公司（印度甘地罕），Maple Biotech（P）Ltd公司（印度浦那）的纤维素纤维，美国MP biomedicals公司的矿物质混合物，Sigma-公司的l-半胱氨酸，胆碱酸胆碱盐和叔丁基对苯二酚 Aldrich Company（美国圣路易斯）。

a.酪蛋白由中央药房（P）有限公司（印度新德里）提供，玉米淀粉和糊精玉米淀粉（饲料级）由Vijaya Enterprises（印度孟买）提供，蔗糖由Sisco研究实验室（印度孟买）提供，大豆油由 Bharat Foods合作社有限公司（印度，甘地），Maple Biotech（P）Ltd，（印度，浦那）的纤维素纤维，美国MP biomedicals公司的矿物质混合物，Sigma-公司的l-半胱氨酸，胆碱，酒石酸胆碱和叔丁基对苯二酚 Aldrich Company（美国圣路易斯）。

维生素混合物AIN-93-VX（g / kg）烟酸3.0，泛酸1.6，吡ido醇盐酸盐0.700，硫胺盐酸盐0.600，核黄素0.600，叶酸0.200，d-生物素，维生素B12（0.1％甘露醇）2.500 ，alpha;-生育酚粉（500 IU / g）15.00，维生素A棕榈酸酯（250,000 U / g）1.6，维生素D3（400,000 U / g）0.25，苯醌0.08，蔗糖959.7。

2.3 实验设计
将小鼠随机分为14个不同的组，每组五只动物，在相同的条件下进行分组，分组如下：

第1组 用作CD补给对照（CD-C），并且未被照射。

第2组 用作NSD补给对照（NSD-C），并且不进行辐照。

第3、4和5组 以CD为食的动物分别接受了2、4和6 Gy的60Cogamma;射线辐照，辐照24 h后取出肝脏。

第6、7和8组 CD喂养的动物分别接受了2、4和6 Gy的60Cogamma;射线辐照，辐照48小时后取出肝脏。

第9、10和11组 NSD喂养的动物分别接受了2、4和6 Gy的60Cogamma;射线辐照，辐照24 h后取出肝脏。

第12、13和14组 NSD喂养的动物分别接受了2、4和6 Gy的60Cogamma;射线照射，并且在照射48小时后取出了肝脏。

如上所述，通过断颈法杀死动物，并在不同的时间间隔后取出肝脏。按照BARC（Bhabha Atomic Research Center）动物伦理委员会发布的指南进行处理和处死小鼠。通过使用60Co Theratron Junior Teletherapy装置（加拿大渥太华加拿大原子能有限公司）以50 cGy / min的速度对动物（6周大）进行全身gamma;辐射。接触面积保持恒定。

2.4 用于NAMPT和NMNAT定量的样品制备
用磷酸盐缓冲液冲洗肝组织至少两次。向100 mg切开的组织中加入1 ml细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl; pH 7.5，5 mM EDTA; 150 mM NaCl; 0.1％月桂基硫酸盐，去离子水（DW）中的钠盐; 0.5％脱氧胆酸 DW；在DW中加入1％Igepal CA-630；加入蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯），孵育15分钟，然后将样品以及细胞裂解缓冲液转移至预冷却的微量匀浆器将组织匀浆，将裂解的细胞离心（12,000times;g，10分钟），将含蛋白的上清液移至冷却试验中，并置于冰上直至用于NAMPT和NMNAT定量。
2.5 NAMPT和NMNAT测定

通过夹心免疫测定法（Nampt（小鼠/大鼠）细胞内ELISA试剂盒，Biovision研究产品，CA，USA）测定NAMPT。简而言之，它是指将含有NAMPT的样品与捕获抗体和过氧化物酶标记的检测抗体一起孵育，以形成稳定的免疫复合物。用四甲基联苯胺为底物使结合至复合物的过氧化物酶显影。光度测定的颜色（在450 nm处）与NAMPT蛋白浓度成正比。 Nampt水平表示为NAMPT蛋白（皮克）/肝脏（克）。
如上所述，通过分光光度法连续耦合NMNAT和醇脱氢酶反应确定NMNAT活性[35]。NMNAT耦合测定系统包含0.24 ml 100 mM Hepes（pH 7.4），其中包含40 mM MgCl2、0.1 ml 12.5 mM ATP，0.02 ml mM NMN，0.05 ml 0.50 mg / ml酵母酒精脱氢酶（ADH）（6单位），0.39 ml 1 ml反应混合物中加入乙醇和8mu;g酶蛋白。通过加入底物NNN开始反应。该测定基于340 nm处吸收的显著增加，当使用乙醇作为底物的ADH进一步减少NAD形成时，就会发生这种吸收。用线性进程曲线的斜率计算酶活性。 Nmnat活性表示为国际单位每克肝脏。活性的一个国际单位定义为相当于在测定条件下每分钟将1mu;molNMN转化为NADH所需的酶。

2.6 NAD 和ATP定量
NAD 是通过较早描述的酶循环方法在组织中测量的[36]，在我们的实验室中略有修改。在4°C下用PBS洗涤组织（100 mg），切碎并在4°C下用500mu;l0.5 N高氯酸萃取两次，每次20分钟。用1 ml 1 N KOH中和1000 g收集的酸性上清液10分钟。 0.33 M KPO4，pH 7.5。在冰上放置1 h后，通过在4°C下以2000times;g离心15 min沉淀出KClO4；将上清液保存在-20°C直至NAD 分析。 NAD 分析系统的总体积为170mu;l，50mu;l样品（或0-20 pmol标准NAD ）和100mu;l反应混合物，最终浓度为0.1 M Bicine，pH 7.8； 0.5 M乙醇； 4.17 mM EDTA，0.83 mg / ml BSA; 0.42 mM 3- [4,5-二甲基噻唑-2-基] -2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）； 1.66 mM吩嗪乙醇硫酸盐。通过添加2 U醇脱氢酶（0.1 M Bicine中的20mu;l0.3

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