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快速高效液相色谱-质谱法同时测定茶叶中的儿茶素和叶酸含量

摘 要

采用高效液相色谱-质谱法同时分离茶叶中含量最丰富的儿茶素，没食子酸和咖啡因的方法，用ZorbaxSB-C₁₈填充了2pm分子，进行了线性梯度洗脱，这些化合物在九分钟内迅速分离。该方法不需要制备和半制备的HPLC步骤。事实上，在本篇研究中，用液相色谱-质谱法可以很容易地分析出被稀释的茶叶样品。使用质谱检测定量的儿茶素，确保了更高的特异性的方法。茶饮料和茶提取物中检测的大多数化合物的相对标准偏差普遍低于4%和7%。此外，该方法对单独或与儿茶素联合测定叶酸含量具有很好的分辨率。到目前为止，文献中还没有高效液相色谱法能快速鉴别儿茶素和叶酸的方法。

关键词 绿茶；儿茶素；叶酸；高效液相色谱法；质谱分析

1介绍

绿茶是一种未经发酵的茶，已经成为世界上最广泛消费的饮料之一。事实上，绿茶富含类黄酮(300-400mg/g)并且含有大量儿茶素，其含量可达绿茶干重的20-30%，茶中含量最丰富的八种儿茶素是儿茶素(catechin，C)、表儿茶素(epicatechin，EC)、没食子儿茶素(gallocatechin，GC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、儿茶素没食子酸酯(catechingallate，CG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate，GCG)及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)。茶中主要的儿茶素以其强大的抗氧化活性和对健康有益而闻名，包括抗病毒、抗过敏、抗炎症和抗癌属性。除了儿茶素，绿茶还含有其他多酚类物质，如没食子酸，主要的是茶多酚酸，以及一定量的生物碱，如咖啡因。虽然咖啡因由刺激作用，但也有报道称，咖啡因对人体健康也有有益于心血管、胃肠和呼吸系统的作用。咖啡因也会影响茶的味道，绿茶中的儿茶素、酚酸和咖啡因的成分因品种、气候和园艺条件的不同而不同，主要是由于所应用的技术不同。

叶酸在减少新生儿神经管缺陷和心血管疾病风险方面发挥着关键作用。叶酸(FA)不是一种重要的天然形式的叶酸，而是脂肪酸合成生产的，用作膳食补充剂，因为它是最稳定的形式。L-5-甲基四氢叶酸(L-S-MTHF)是一种天然形式的叶酸，它比叶酸更有生物活性。然而，它的稳定性有限，尤其是暴露在氧气、光线或高温下时。Rozoyetal.表明L-5-MTHF可以通过添加抗坏血酸来控制。一些研究已经证明，表没食子儿茶素没食子酸酯的抗氧化能力超过抗坏血酸至少100倍。因此，使用具有强抗氧化活性的分子，如儿茶素，可能是保护L-5-MTHF抗氧化的一种有效的选择。

迄今为止，高效液相色谱(HPLC)仍然是测定儿茶素的最常用技术。传统的高效液相色谱-紫外光电二极管阵列(DAD)、电化学检测和质谱(MS)是鉴定儿茶素最常用的方法之一。一般分析时间较长，需要40-105min，可同时分离5到10之间的有效化合物。从定量的角度来看，快速高效液相色谱方法还没有被广泛的研究，只有少数的工作报道了在相对较短的时间(25分钟)内同时分离所有的茶儿茶素，最近，超高压液相色谱(UHPLC)在速度和分离效率方面显示出相当大的潜力。然而，UHPLC仍然相对较新，需要能够承受1000bar压力的专用设备。到目前为止，UHPLC用于茶叶样品中儿茶素分析的应用报道很少，为了提高色谱的效率和快速性能，可以采用几种策略。一种有趣的方法是评估填充了2mu;m粒子的色谱柱的使用情况。正如30年前Knox、Martin和其他作者所描述的那样，使用填充小颗粒的短柱可以提高效率、最佳速度和传质。

本研究的目的是建立一种高效、快速的高效液相色谱法同时分离茶叶样品中的儿茶素、没食子酸和咖啡因。为了评价该方法在其它复杂基质中的分辨率，将该方法应用于叶酸的测定。同时，还对L5-MTHF与绿茶富集提取物进行了色谱分析，以评价该方法在复杂溶液中的分析性能。为了进行更快的分析，传统的高效液相色谱系统配备了ZorbaxStableBond(SB)Clig分析柱(4.6times;50mm)填充1.8mu;m颗粒。采用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)相结合，对茶叶样品中的儿茶素、叶酸等成分进行了灵敏度和选择性的鉴定。据我们所知，还没有关于同时分离儿茶素和叶酸的方法发表。

2材料与制备方法

化学样品的制备

样品购自Sigma化学公司:没食子酸（GA，98%），(-)-没食子儿茶素(GC，98%)，(-)-表没食子儿茶素(EGC、98%)、( )儿茶素(C，98%)、(-)表儿茶素(EC、98%)，(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，95%)，(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG98%)，(-)表儿茶素没食子酸盐(ECG，98%)、(-)儿茶素丙酸酯(CG，98%)和咖啡因(CAF，99%)。使用西门子PurelabUItra水净化系统获得高效液相色谱级水。HPLC级乙腈和甲酸分别购自VWR国际公司和Sigma-Aldrich公司。

将每个5-10mg的标准化合物溶于10mLHPLC级水/甲酸（99.9:0.1v/v）中制备储备液。然后用每种原液配制标准混合物。然后用甲酸溶液进行连续稀释，得到3-50mu;g/mL不同浓度下的校准曲线。所有标准溶液通过0.2mu;mPVDF注射器过滤器过滤。将10mu;L的溶液等量注射到HPLC上。

HPLC-MS分析

高效液相色谱UV-MS分析在一个安捷伦1100系列高效液相色谱系统配备一个安捷伦二极管阵列紫外可见检测器(AgilentG1315DAD)，真空脱气装置，一个二进制泵输送(AgilentG1312A)，冷藏自动进样器(AgilentG1329A)，和一个惠普质谱检测器(MSD、模型G1948B)。采用Chemstation软件(LC/MSDChemstationB.01.03SR1)进行整合和数据处理。色谱柱为AgilentZorbaxSB-Cis(4.6mmidxSOmm，1.8mu;m)，柱前过滤器。采用流动相进行MS分析，流动相包括0.2%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B)(HPLC级别，美国新泽西吉布斯敦EMD化学公司)。线性梯度洗脱体系为:0~8min，B的浓度为0~5%(v/v);8-10min，B的5-25%(v/v);10-17min，25-100%(v/v);流速为1ml/min时，17-23min，100-5%（v/v）。紫外分光光度法在230nm波长下测定儿茶素含量，柱温保持在25℃，进样量为10mu;L。

使用同一色谱柱的HPLC-DAD进行质谱分析，以正电离模式记录儿茶素，使用电喷雾(API-ES)电离源，以氮气作为干燥气体。喷雾室参数为:毛细管电位3000v;气体温度:350℃;干燥气流量，13L/min;喷雾器压力，60psi。采用扫描方式进行质谱定量分析，扫描范围150-1000m/z，以分子离子[M H]作为最丰富和最具代表性的信号，将片段值设为70V，通过将未知峰的保留时间和质谱与标准品的保留时间进行比较，用HPLC-MS对化合物进行鉴定。

绿茶样品的制备

浓缩绿茶饮品，一款由实验室开发的富含表没食子儿茶素没食子酸酯的茶饮品且是根据Bazinet等人开发的程序。本实验中使用的绿茶是一种可在市场上买到的绿茶，日本绿茶从当地零售商那里获得。使用前，将绿茶置于真空袋中，室温下避光干燥存放。富含表没食子儿茶素没食子酸酯的茶饮料的产量为100升，生产条件和单位操作类似于食品行业生产低酸饮料的条件和操作。将3.5公斤的干叶用100L的水冲泡两次。第一个酿造步骤在30plusmn;2℃下进行10分钟，使用不锈钢双夹套加热的储液器。滤液经过过滤，分离叶子，收集滤液。将过滤后的茶叶用100L的水在80plusmn;2℃的条件下再次冲泡，挤压后丢弃。在第二滤液中加入柠檬汁调节pH值为3.5。然后将富含富含表没食子儿茶素没食子酸酯的绿茶进行巴氏杀菌，无菌装瓶，并在4℃保存。

浓缩绿茶的提取

本实验室使用第二滤液，根据前面引用的程序制备浓缩冻干茶提取物。该提取物的pH值未调整到3.5。提取液在30℃冷冻48小时，并且在25℃冻干72小时(Virtis，Gardiner，NY，USA)。将400毫克的提取物用高效液相色谱级水稀释到25毫升。所有茶叶样品均经0.2mu;mPVDP注射器过滤器过滤。将10uL的茶叶样品注入高效液相色谱法。所有茶叶样品一式三份，每个样品共进行九次分析。

制备叶酸：叶酸和L-5-MTHE分别在227mu;m浓度的ches-hepes缓冲液中制备。然后在罗宾森缓冲液中，用1mML-5-MTHE溶液制备富含绿色提取物（400mg/L），并用高效液相色谱-质谱法分析结果。

数据分析

校准曲线使用标准溶液，线性度评估超过6个校准点，每个校准点有3个测量值。检测限(LOD)和定量限(LOQ)的确定依据ICH协调三方指南(分析方法验证:文本和方法学Q₂(R₁))。

方法的重复性以相对标准偏差百分比(%RSD)表示，方法采用连续3天对每个样品进行3个重复的高效液相色谱分析。相对标准偏差(RSD)定义为样本标准差除以样本均值，再乘以100%。

3结果与讨论

描述改进方法学的发展

建立了反相高效液相色谱-质谱联用技术。两种流动相，一种为高效液相色谱级水，另一种为乙腈。在两个流动相中都加入了甲酸，流动相中酸的存在对儿茶素的完全分离至关重要。此外，据报道儿茶素在酸性条件下最稳定本研究测试了两种不同浓度的甲酸(0.1和0.2%)。虽然0.1%的甲酸在两个流动相中都获得了良好的分离效果，但在水流动相中加入2%甲酸后，得到了改进的峰形。使用甲酸的另一个原因是它与质谱的相容性。不同的吸收波长已在文献中报道用于测定茶儿茶素，从210到280nm不等。在我们的研究中，儿茶素、没食子酸和咖啡因在210和230nm处表现出最大的吸光度。210nm处的吸光度略大于230nm处的吸光度，但色谱基线位移增加。叶酸的最大吸光度为280-290nm。在最短波长(230nm)也观察到强吸收。然后将检测器波长设置为230nm，以达到所有感兴趣化合物最大吸光度的最佳折中值。为了提高分离效率和分析速度，高效液相色谱系统配备了ZorbaxSB-C₁₈柱(4.6mmidx50mm)。使用小颗粒是提高色谱性能的最佳解决方案之一。31-34此外，短柱和高流速可保持良好的效率。另一方面，ZorbaxSB-C₁₈色谱柱的特殊和超纯二氧化硅支撑，旨在减少或消除分析物和二氧化硅表面之间的不良相互作用，从而提供所有化合物的最佳分离。它特别适用于使用高灵敏度探测器的应用，如质谱仪。

将ZorbaxSB-Cis1.8mu;m色谱柱与YMC-Pack ODS-AM C₁₈5mu;m色谱柱进行了比较，该色谱柱已用于儿茶素的测定。两柱在相同条件下进行测试。Zorbax列给好的分离的所有分析物在9分钟内(图1)。然而，这个YMC-Pack ODS-AM列没有达到令人满意的EC，EGCG，ECG和CG在水/乙腈/甲酸体系，分离时间长一般(47分钟)(数据没有显示)。在这种情况下，ZorbaxSB-C₁₈柱的分析时间和溶剂消耗减少了5.2倍。

YMC-Pack ODS-AM的性能在我们之前的工作中，将三氟乙酸加入到流动相中，色谱柱效果更好，用高效液相色谱法定量测定茶叶中儿茶素、酚酸和咖啡因的关键步骤是样品提取。萃取方法必须能够在不进行化学修饰或降解的情况下完全萃取所要的化合物。目前，用乙腈和甲醇单一萃取步骤测定茶叶中的多酚已被广泛应用。然而，我们的方法可以在不使用任何溶剂的情况下定量测定茶叶中的儿茶素。实际上，在沸水中制备茶叶样品后，样品只需要在HPLC分析之前进行稀释和过滤。在40-120V的片段范围内记录儿茶素的质谱，以确定每个分子的最高灵敏度。在所有检测到的离子中，选择70V为最佳折中值，并应用于茶叶样品中。该方法在负电离模式和正电离模式下进行了测试，但当质谱仪在正电离模式下工作时，具有更好的灵敏度和显著的信噪比响应改善。Pelillo等也报道了用正离子检测获得的绿茶提取物的HPLC-MS分析的信号响应更好。HPLC-MS分析及峰值鉴定。GA、儿茶素和CAF混合标准品的典型色谱图为图1所示。对此分离，生成的返回压力在220MPa左右，与常规HPLC系统非常兼容(HPLC标准压力，高达400bar，40MPa)。

图1所示。UV-DAD记录了GA、儿茶素和CAF混合标准品在230nm处的色谱图。GA,没食子酸;GC，儿茶素;EGC儿茶素;C，儿茶素;CAF，咖啡因;EC，表儿茶素;EGCG，儿茶素;GCG，儿茶素没食子酸盐;ECG，表儿茶素没食子酸盐；CG，儿茶素没食子酸盐

该方法的

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