多中心切割手性-手性二维液相色谱法分离十二种泊沙康唑相关立体异构体外文翻译资料

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多中心切割手性-手性二维液相色谱法分离十二种泊沙康唑相关立体异构体

摘 要

泊沙康唑是一种三唑类抗真菌药，用于治疗各种真菌感染。它含有4个手性中心，形成16种立体异构体。采用收敛合成路线时，活性药物成分(API)中可能仅存在11种相关的立体异构杂质。一次性分离所有立体异构体是一个挑战。针对这一问题，建立了多中心切割手性-手性二维液相色谱法(2D-液相色谱法)。多中心切割2D-液相色谱分离是在2D-液相色谱系统上进行的，该系统有三个固定有多糖手性固定相的手性柱，即Chiralpak IB、IC和IF3。系统中采用Chi-ralpak IB柱作为1D分离柱，IC和IF3柱并联用于2D分离。多中心切割手性-手性2D-液相色谱系统一次即可很好地分离出12种立体异构体。

关键词 手性药物；多手性中心立体异构体；二维液相色谱法

1. 介绍

手性药物的立体异构体在性能、毒性和药效学方面可能不同。因此，立体异构体的分离是药物开发和质量控制过程中的一项非常重要的工作^[1,2]，手性药物密切相关的立体异构体混合物的分离仍然是药物分析中的一个挑战^[1,3,4].为了解决这个问题，在过去的几十年里，已经开发了各种采用非手性或手性-手性柱构型的二维液相色谱(2D-液相色谱)方法^[5-13]。心脏切割(LC-LC)是最早开发的2D-LC格式，已广泛应用于药物分析中分离密切相关的化合物(结构相关的杂质、异构体或降解产物)^[14]。中心切割2D-液相色谱通常通过具有正交选择性的柱耦合来进行，例如反相模式与手性模式耦合^[15]。在中心切割2D-液相色谱中，只有一维分离中感兴趣的一个(或多个)峰部分会被转移到2D柱中。因为手性柱对非手性化合物的分离选择性有限和非对映异构体，它们主要用于2D分离。中心切割2D-LC可分为单次中心切割和多次中心切割(mLC-LC)。mLC-LC允许将第一维度中的一个以上部分单独转移到第二维度。近年来，手性超临界流体色谱(SFC)因其高速和效率而被用作第二个维度^[16]。此外，核壳粒子和UHPLC技术的引入使得超快分离在某些情况下不到一秒钟。分析时间的减少使得在综合2D-液相色谱(LCtimes;LC)模式下分离立体异构体成为可能。最近，Barhate等人发展了一种RPLCtimes;手性-LC和手性-LCtimes;手性-LC方法，在第二维使用超快速手性色谱法分离和分析密切相关的药物和合成中间体的复杂混合物，包括手性和非手性药物和代谢产物^[10]。

当分析含有多个手性中心的手性药物时，由于立体异构体的数量将增加到2n，分离情况变得更加困难。一个实例是泊沙康唑，其代表用于治疗由scedosporium和镰刀菌属物种引起的侵袭性曲霉病、念珠菌病和真菌感染的广谱三唑抗真菌剂^[17]。它有四个手性中心，导致16种潜在的立体异构体。然而，对于收敛的合成路线，在活性药物成分(API)中可能仅引入11种相关的立体异构杂质。因此，需要一种方法来监测API中的立体异构体。文献报道了泊沙康唑对映体的分离和杂质依南噻吗姆的测定^[18]。然而，据我们所知，尚未报告在一次运行中同时分离12种泊沙康唑相关立体异构体的方法。

在本研究中，我们建立了一种多中心切割2D-液相色谱法来分离泊沙康唑的12种立体异构体。该方法在具有三个手性柱和固定化多糖手性固定相的2D-液相色谱系统上进行。使用多重切心手性-手性2D-LC，可在一次操作中很好地分离十二种立体异构体。该方法可用于泊沙康唑制备过程中立体异构体的监测。

2. 实验段

2.1 使用仪器

对映体分离条件的筛选在Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo Fisher，CA，USA)上进行。对于2D-LC分离，在Agi-lent 1260 HPLC系统(德国Waldbronn)上进行1D分离，在由两个JASCO PU-2080 Plus泵(日本东京)和两个Shimadzu SPD-15C紫外线检测器(中国苏州)组成的HPLC系统上进行2D分离。这两个系统通过一个两位六端口和一个两位十端口切换阀连接，它们都由Agilent Chemstation软件系统控制。

固定化多糖手性固定相手性柱，包括Chiralpak IA，IB，IC，ID3，IE3，IF3，IG均购自Daicel手性技术(中国上海)。这色谱柱尺寸为250times;4.6 mm内径(5微米)。Agilent Technologies(美国加利福尼亚州)的ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150mmtimes;4.6mm，5微米)和Agela Technologies(中国天津)的硅胶色谱柱(100mmtimes;4.6 mm，5微米)用于achi-ral分离。对于所有分离，检测波长设置为UV 262nm。由于样本吸附导致峰拖尾，因此在流动相中加入了0.1% (v:v)二乙胺(DEA)，以改善所有组分的峰形。

2.2 化学品和试剂

己烷、甲醇、乙腈和异丙醇(IPA)均购自Merck(德国达姆施塔特)。二氯甲烷(DCM)购自紫水晶(Jamp;K，北京，中国)。乙醇购自Macklin(中国上海)。二甲胺(DEA)购自适马-奥尔德里奇(MO，USA)。使用Milli-Q梯度A10系统(Millipore，MA，USA)对水进行纯化。所有溶剂均为HPLC级。泊沙康唑(PSZ)及其11种立体异构体的标准物质表示为PSZ-E、A、A-E、B、B-E、C、C-E、D、E、F和G，由Ausun Pharmaceutical(中国浙江台州)提供。这里，A、B和C的n分别表示为A-E、B-E和C-E。所有立体异构体及其绝对构型的相应化学结构见图1。

2.3 样品制备

十二种泊沙康唑相关立体异构体可自由溶于二氯甲烷和乙酸乙酯，其在甲醇和乙腈中的溶解度约为4mg/mL，但在己烷或水中几乎不溶。在甲醇中制备浓度为3mg/mL的每种化合物的贮备溶液。它们被稀释了，使用己烷/异丙醇混合物(2:1，v/v)50次，用于正相分析。对于反相分析，用H2O和甲醇的混合溶剂(1:2，v/v)稀释贮备溶液。

3. 结果和讨论

3.1 分离条件的筛选

最初，使用12种立体异构体的混合溶液在各种基于多糖的手性柱上筛选分离条件。在所有流动相系统中加入0.1% EDA是必要的，以改善峰尾的峰形。在筛选实验中，我们发现几乎有一半的立体异构体强烈保留在基于多糖的chi-ral柱(IB柱除外)上，导致洗脱时间非常长。在流动相中加入二氯甲烷(DCM)可以显著缩短保留时间，而不会显著影响选择性。因此，在我们的实验中只能使用带有固定化多糖固定相的手性柱，即允许在流动相系统中使用二氯甲烷的Chiralpak IA, IB，IC，ID3，IE3，IF3，IG^[19]。

图1 12种泊沙康唑相关立体异构体的结构及其绝对构型

图2 用于条件筛选的色谱图

图3 IB柱上立体异构体的洗脱顺序以及IC和IF3柱上组分的分离选择性

图4 多中心切割2D-高效液相色谱系统示意图

图5 在心脏切割2D-液相色谱系统上分离12种泊沙康唑相关立体异构体的色谱图

条件：采用IB柱(4.6mmtimes;250mm，5微米)进行1D分离，IC (4.6mmtimes;250mm，5微米)和IF3色谱柱(4.6mm，250mm，3微米)分别为用作2D分离。色谱柱温度设置为25℃。IB和IC色谱柱的流速设置为1.0 mL/min，IF3色谱柱为0.5mL/min；在262nm紫外线下检测样本。

立体异构体在IC色谱柱上的保留最强，而在IB色谱柱上的保留最弱。通过调整流动相中己烷、异丙醇和DCM的比例，优化分离条件。获得的结果如所示图2。各色谱图顶部列出了优化的流动相组成。从中可以看出图2不可能在任何手性柱上分离所有的立体异构体，在IC和IB柱上只能得到相对较好的分离。我们还尝试了反相模式下的C18色谱柱，以及正相模式下的硅胶色谱柱。然而，非手性柱的选择性更差(数据未显示)。因此，我们决定尝试手性-手性构型的多中心切割2D-液相色谱系统。

基于初始实验中获得的结果，我们选择IB柱作为1D分离，因为它为所有立体异构体提供了保留最弱的最佳选择性。此外，IB色谱柱上使用的流动相在其他色谱柱上的洗脱强度较弱。因此，第一维度的效率对第二维度的性能的影响将被最大程度地降低。我们从1D分离中切下的部分将聚焦在2D柱的顶部，以避免峰展宽。随后通过分别注射每种立体异构体来确定IB柱上立体异构体的洗脱顺序。IB色谱柱上获得的色谱图如所示图3。我们可以清楚地看到，每对对映异构体都可以进行基线分离，但有些非对映异构体在色谱柱上是同时稀释的。

2D分离柱的选择基于中所示的结果图2和3。我们可以很容易地发现，交替使用IF3和IC柱作为2D分离柱可能能够分离从IB柱共洗脱的四种组分。在我们的实验中，IC柱被用作2D柱1，IF柱被用作2D柱2。

3.2 中心切割2D-液相色谱分离

中心切割2D-液相色谱系统如图所示图4。在我们的实验中，所有分离均采用等度洗脱形式，因此可以简化溶剂输送系统。2D-液相色谱系统的接口由一个内置的六端口和一个插入式十端口两位转换阀组成。IF3和IC色谱柱直接连接至六端口阀和十端口阀，无需使用任何样本环路。从1D分离中洗脱出来的四个碎片被直接切割到2D连续列。由于IB柱中所用流动相的洗脱强度远弱于2D分离中所用流动相的洗脱强度，因此可将注射样本截留并聚焦在柱头上，以避免稀释样本区。

通过多中心切割2D-液相色谱法分离12种立体异构体的色谱图见图5。将级分1 (F1)切至2D柱IF，表示为D和E的立体异构体可在18 min内基线分离。随后，将级分2 (F2)切割成IC柱。该组分含有3种立体异构体，可在25 min内在2D色谱柱中进行基线分离。随后，F3切为IF3柱，F 4切为IC柱。因此，可以基线分离所有立体异构体。

研究了切割时间对二维柱分离效率的影响。我们希望切割时间足够长，以允许我们将1D柱中的全部峰转移到2D柱中。为此，级分1和2的切割时间为5.8分钟，级分3为9分钟，级分4为5.1分钟。我们比较了在立体异构体的1D-液相色谱分离中获得的色谱图(图3)和在2D-LC分离中获得的那些(图5)可以看出，除了轻微的峰宽外，没有观察到异构体保留时间的显著差异。这表明切割时间对第二次分离的性能没有显著影响，因为注射的样品会聚焦到色谱柱头上。

4. 结论

开发了一种手性-手性多中心切割2D-液相色谱法，用于在一次操作中分离12种泊沙康唑相关立体异构体。根据对气相色谱柱和流动相系统条件的筛选结果构建了2D-液相色谱系统。对立体异构体保留相对较弱的IB柱用作1D分离柱，而对立体异构体保留较强的IF3和IC柱用作2D分离柱。因此，当我们将1D分离中感兴趣的峰转移到2D色谱柱时，这种配置可以避免样本稀释。此外，样品切割时间对2D分离的影响也显著降低。我们的工作表明，手性-手性多中心切割2D-液相色谱是分离含有多个不对称中心的手性药物立体异构体的有力分离工具。可作为其他多不对称中心药物分析的方法学参考。lt;

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