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附录 外文译文

蛋白质分子：将蛋白质靶向到Skp1-Cullin-Fbox复合物上进行泛素化和降解的嵌合分子

坂本 K M ,金凯斌，熊谷，F·默库里奥，C M 克鲁斯，R J 德赛斯

加州大学洛杉矶分校美泰儿童医院儿科和病理学系，加州大学洛杉矶医学院，格温黑森樱桃纪念实验室，琼森综合癌症中心，加州CA 90095-1752；加州理工学院霍华德休斯医学研究所生物部，帕萨迪纳，加州CA 91125；耶鲁大学分子、细胞和发育生物学系，纽黑文，CT 06520；信号部，拉霍亚，CA 92121

由亚历山大·瓦尔沙夫斯基交流，加州理工学院，帕萨迪纳，加州，2001年5月10日（2001年3月29日收到以供审查）

许多蛋白质的细胞内水平受到泛素依赖的蛋白质水解的调节。催化泛素连接到蛋白质上的最典型的酶之一是泛素连接酶复合物，包含Hrt1的Skp1-Cullin-Fox复合物（自洽场）。我们试图人工将一个蛋白质靶向到自洽场复合物上进行泛素化和降解。为此，我们测试了蛋氨酸氨基肽酶-2(MetAP-2)，它共价地与血管生成抑制剂卵圆素结合,合成了一种嵌合化合物，蛋白靶向嵌合分子1(Protac-1)，将MetAP-2招募到自洽场中。Protac-1的一个结构域包含被F-box蛋白beta;-TRCP识别的Ikappa;Balpha;磷酸肽，而另一个结构域则由卵圆霉素组成。我们发现MetAP-2可以与SCF^beta;-TRCP结合后发生泛素化，并以protac-1依赖的方式降解。在未来，这种方法可能用于条件失活，并靶向致病蛋白进行破坏。

细胞蛋白的降解是正常维持细胞功能所必需的，包括增殖、分化和细胞死亡。泛素依赖的蛋白质水解是在翻译后调节蛋白质的主要途径之一。泛素化是通过泛素激活酶(E1)、泛素偶联酶(E2)和泛素蛋白连接酶(E3)的活性发生的，这些酶依次催化泛素附着在底物蛋白^[1]的赖氨酸残基上。E3通过直接与底物结合，赋予泛素化反应特异性。虽然E3的确切数量不能从序列数据中确定，但很可能会有。人类基因组^[2]中编码的100个不同的F-box的E3。一种特殊的E3，异四聚体Skp1-Cullin-Fbox（自洽场）复合物，由Skp1、Cullin家族成员、RING-H2蛋白Hrt1(也称为Roc1或Rbx1)和Fbox蛋白^[3]组成。这些成分都是从酵母到哺乳动物保存下来的。哺乳动物的Fbox蛋白，beta;-TRCP/E3RS，已被证明可以与NFkappa;b^[4]的负调控因子Ikappa;Balpha;结合。SCF^beta;-TRCP复合物促进IkBa的泛素化和随后的降解，从而导致炎症反应过程中NFkappa;B的激活^[3]。

Ikappa;Balpha;向SCF^beta;-TRCP的募集是由Ikappa;Balpha;中的一个10-aa肽介导的^[4,5]。为了响应不同的炎症信号，IkBa激酶(IKK)磷酸化这两个丝氨酸上的这个基序，从而触发Ikappa;Balpha;与beta;-TRCP的结合。因为它是一种特定泛素连接酶的明确配体，我们试图利用这种磷酸肽靶向与SCF^beta;-TRCP不相关的蛋白质进行泛素化和降解。

为证明这个概念，我们测试了Ikappa;Balpha;磷酸肽(IPP)将蛋氨酸氨基肽酶-2(MetAP-2)靶向于SCF^beta;-TRCP的能力。MetAP-2催化从新生的多肽^[6]中裂解N端蛋氨酸，似乎是有效生成抑制剂富马青霉素和卵圆霉素的主要靶点(OVA^[7-8]）。这两种化合物都通过在活性位点共价结合His-231来抑制MetAP-2。随后导致的MetAP-2活性的降低被认为是通过在细胞周期^[9]的G1期引起p53依赖性的阻滞来阻断内皮细胞的增殖。重要的是，MetAP-2还没有被泛素化或形成任何自洽场复合物的底物。

为了确定MetAP-2是否可以人工靶向于SCF^beta;-TRCP，我们合成了同时包含IPP和OVA的蛋白水解靶向嵌合分子1(Protac-1)。我们假设磷酸肽部分将结合beta;-TRCP，OVA部分将与MetAP-2结合，从而招募MetAP-2到SCFbeta;-TRCP进行泛素化(图1a)。我们推断，这种策略可能有效，因为连接不同蛋白质的合成配体已被证明能够调节体内^[10]的信号通路。在这篇文章中，我们报道了Protac-1确实将MetAP-2与SCF^beta;-TRCP结合，从而促进MetAP-2的泛素化和降解。证明Protac-1介导自洽场对外源底物的泛素化和降解，为开始在体内测试Protacs以及其他已知的促进疾病的靶点提供了基础。

图1

1. Protac-1将MetAP-2靶向到自洽场。Protac-1是一种嵌合分子，由一个磷酸肽部分和一个与蛋白质目标相互作用的小分子部分组成。Ub、泛素；H、Hrt1。
2. Protac-1的合成方案（见材料和方法）。Fmoc，氟烯基甲氧基碳基；DMF，二甲基甲酰胺；DMAP，二甲基甲酰胺吡啶；DSS，二琥珀酰亚胺酯。

材料和方法

IkBa-OVA蛋白的合成

将OVA(1.4mmol)在0°C的10mL甲醇中溶解，缓慢加入硼氢化钠(3.0mmol)。搅拌30min后，在减压下除去甲醇，用闪速柱层析纯化粗产物，得到ovalicinol(1.15mmol，82%)。Fmoc-Gly与ovalicinol偶联得到Fmoc-Gly-ovalicinol。具体来说，将二甲基甲酰胺(DMF，28ml)加入到含有Fmoc-Gly-OH(3.56mmol)和氧乙酰氯(7.12mmol)的二氯甲烷溶液(30ml)中。在室温下搅拌3小时后，在氮气气氛下去除二氯甲烷。将得到的固体残渣重新溶解在10ml二氯甲烷中，并与ovalicinol(0.6mmol)和二甲氨基吡啶(4.7mmol)溶于30ml二氯甲烷，将反应混合物在室温下搅拌2小时。在减压条件下去除二氯甲烷后，得到的残留物经过闪光柱色谱法得Fmoc-Gly-ovalicinol(0.39mmol，65%)。然后，取含20%哌啶的Fmoc-Gly-ovalicinol(0.09mmol)溶于2mlDMF，置于室温10min，在高真空下去除DMF。将得到的固体重新溶于2mlDMSO中，在室温下加入二琥珀酰亚胺亚酯(0.9mmol),搅拌过夜后，在高真空下去除DMSO，所得粗产物使用闪光色谱法提纯，得到单琥珀酰亚胺-甘氨酸戊烷醇(0.06mmol，68%)。

将单琥珀酰亚胺-甘氨酸戊烷醇(12mu;mol)溶于0.6mLDMSO，加入含有Ikappa;Balpha;肽(3.67mu;mol)和二甲胺吡啶(11mu;mol)的DMSO溶液(1mL)中。在室温下搅拌20min后，偶联反应完成，并经Kaiser试验证实。在高真空下去除DMSO，用二氯甲烷和甲醇反复洗涤粗产物，去除多余的单琥珀酰亚胺-甘氨酸戊烷醇，最终得到甘氨酸卵氨酸醇(5.8mg，2.59mu;mol，70%)。采用电喷雾(ES)质谱法对最终产品进行了表征。戊氨二醇-甘氨酸-Ikappa;Balpha;肽二甲氨基吡啶的ES-MS(M H) 为2231.56 Da。所有其他中间体均采用500-MHz ¹H NMR进行光谱表征。

MetAP-2-Protac-1偶联试验

MetAP-2(9mu;M)与浓度不断增加的Protac-1（溶解在水中）在室温下反应45min。反应中添加SDS负载染料，在SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜上，用兔多克隆抗MetAP-2抗血清(Zymed)免疫印迹。采用法玛西亚检测试剂进行增强化学发光。

组织培养和转染

293T细胞在含有10%(体积)胎牛血清(GIBCO), 青霉素(100单位/ml)、链霉素(100mg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM中培养。转染日前1：5分将细胞分裂，瞬时转染40mu;g质粒。转染当天，细胞在100mm培养皿中融合60%。加入DNA[20mu;g的pFLAG-Cul1(RDB1347)和20mu;g的pFLAG-beta;-TRCP(RDB1189))]，并使用磷酸钙沉淀法转染细胞^[11]。转染30小时后收集细胞。5微克pGL-1，一种含有与巨细胞荧光蛋白(GFP)cDNA相连的巨细胞病毒(CMV)启动子，同时共转染到细胞中，以评估转染效率。在所有实验中，超过80%的细胞在收获时呈GFP阳性。

免疫共沉淀和泛素化分析。

293T细胞微球用200mu;l裂解缓冲液(25mM Trisbull;Cl, pH 7.5/150mM NaCl/0.1% Triton X-100/5mM NaF/0.05mM EGTA/1mM PMSF)裂解。将转染了载体、pFLAG-beta;-TRCP或pFLAG-Cul-1的细胞中提取的微球涡旋10秒，然后在冰上孵育15min。在埃彭多夫微发酵机（德国）中以13000 rpm离心5min后，向上清液中加入20mu;l FLAG M2(Sigma)中，免疫沉淀前用裂解缓冲液洗涤3次，后免疫沉淀。裂解液在旋转器上孵育2小时，然后用缓冲液A(25mM Hepes缓冲液，pH 7.4/0.01% Triton X-100/150mM NaCl)洗涤，用缓冲液B洗涤(相同的缓冲液没有Triton X-100)。对于结合分析(图3)，将载有50%(10mu;l)的9mu;m MetAP-2/50mu;m Protac-1混合物输入；另外50%加入到珠子中。加入配体后，在室温下旋转1小时。这些珠子分别用缓冲液A和B清洗一次。在埃彭多夫微熔液机（德国）中以13000 rpm离心1min后，一半的珠粒和上清液分别代表结合和未结合，用上述免疫印迹法进行评估。泛素化反应，4mu;l的18mu;M MetAP-2, 4mu;l 的100mu;M Protac-1, 0.5mu;l的0.1mu;g/mu;l 纯化的E1,1mu;l的0.5mu;g/mu;l Cdc34 E2和1mu;l的25mM ATP被添加到20mu;l（包装体积）纯净的FLAG-M2珠子。在对照实验中，IPP(100mu;M)或OVA(100mu;M)与Protac-1同时添加。反应在30℃的热混合器(埃彭多夫)中持续混合孵育1小时。加入SDS/PAGE上载缓冲液终止反应，采用上述Western印迹法进行评价。

本研究中进行的实验使用了两种不同的MetAP-2制剂。一种制剂主要由47-kDa片段组成，该片段由污染的蛋白酶或缓慢的自蛋白水解产生; 第二种制剂几乎全部由全长67-kDa的MetAP-2组成，但两种制剂得到的结果基本相同。

图3 Protac-1将MetAP-2招募到SCF^beta;-TRCP中

将瞬时转染对照载体或表达FLAG表位标记的Cul-1和beta;-TRCP的控制载体或质粒的293T细胞提取物在anti-FLAG树脂上进行亲和纯化，得到对照组或SCF^beta;-TRCP组。然后将基质与预先形成的MetAP-2-Protac-1复合物（输入）混合，孵育，并分离成颗粒（结合）和未结合(sup)组分。蛋白质在SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用抗MetAP-2抗血清进行免疫印迹。MetAP-2和MetAP-2-Protac-1分别是指游离的MetAP-2和MetAP-2与Protac-1的复合物

用非洲爪蟾提取物进行的降解实验。

在实验当天制备未受精的非洲爪蟾卵提取物，如文献(12)所述。将MetAP-2-Protac-1混合物(4 mu;l /9 mu;M MetAP-2和50mu;M Protac-1)或MetAP-2加入10 mu;l除OVA外的提

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