利用DNA条形码的药材鉴定外文翻译资料

利用DNA条形码的药材鉴定

摘要 数百年来，草药在世界范围内被用来维持健康和治疗疾病，然而，中药掺假成为用户和整个行业关注的主要问题。从上世纪90年代中期开始，利用DNA技术鉴定药材被广泛的应用。近年来，全球植物使用四种标准的条形码（rbcL、matK、trnH–psbA和ITS），DNA条形码已成为生物多样性与保护领域的一大焦点。这些DNA条形码也可以作为一种可靠的工具来促进中药的安全使用和中药药材的鉴定及质量控制，取证调查，许多研究已经应用这些DNA条形码来进行中药品种及其混淆品的鉴别。本文综述了在使用标准DNA条形码和其他基于DNA序列的标记进行药材鉴定方面所做的努力。

关键词: DNA条形码，中药材，内转录间隔区（ITS）、matK、分子识别、rbcL，psbA-trnH–psbA。

在许多文化和地区，人们普遍使用草药来维持健康和治疗疾病，这可以追溯到史前时期。即使在今天，全世界80%的人口仍使用传统医学来达到医疗保健和治疗疾病的目的。中国有着悠久的使用草药的历史，包括2000多个属，400多个科，超过10000种草药被人们使用。中草药和医药产品的国际市场是巨大的，而且还在不断增长。2005年，中国中草药产品的年收入总额为140亿美元，2004年，西欧中草药产品的年收入总额为50亿美元。随着中药材市场的不断扩大，中药材掺假成为全球日益关注的问题。草药可被与之密切相关的物种替代或掺入与之无关的植物材料。中药材掺假通常有以下几种情况：（1）药材不具有容易区分的形态特征；（2）材料具有相似的通用名称；（3）以廉价的材料替代有价值的草药。各国政府和制药行业都有义务确保药物都是真实的，安全的，有效的。使用传统的感官和化学方法有时很难识别药材，尤其是对那些由同种植物加工而成或以粉末形式存在的药材。因此，一个准确的，通用的，稳定的和特定的标记，允许非专家从一个微小的组织识别源物种，无疑是有益的。分子技术被认为是中药鉴定的可靠工具，DNA条形码技术是走向统一通用标准的最新一代。近年来，DNA条形码技术已成为生物多样性及保护领域的一大焦点，基于此，我们认为可以考虑使用DNA条形码技术进行质量控制与取证调查。使用DNA条形码技术鉴定药材可以保护消费者免受意外中毒或被不诚实的供应商欺骗，此外，DNA条形码可以作为取证工具来帮助检测有毒药材。

DNA条形码是一种短序列，是基因组的一部分，用于识别物种。总基因组首先是从真正的植物物种的凭证样本中提取，然后是通用引物的PCR扩增和条形码区域的DNA测序。Hebert等人首先提出应用DNA条形码技术为全球物种做鉴定的想法，自那时以来，发展势头显著。根据生命条形码数据系统，截至2011年2月份，共有超过95000种物种的1100000个条形码记录。在过去十年中，已经有超过180 000种植物的DNA条形码被收录于GenBank。

为了规范DNA条形码在国际上的应用，科学界做了相当大的努力，寻找每一个物种合适的DNA区域与条形码，经过反复的评估和应用，发现一个合适的DNA条形码应该符合以下标准：（1）高的普遍性，可以进行植物物种的常规测定；（2）高的序列质量和覆盖率，适合最小基数对双向序列的生产；（3）高辨识度，能区分大多数物种。线粒体细胞色素C氧化酶（CO1）的部分区域，约650 bp，已被用来作为动物的标准条形码。虽然这个区域已被证明在识别鸟类，鱼和昆虫方面非常有效，但是，由于缺乏变化和较低的物种辨识度，并不适用于植物，线粒体基因组结构快速变化的植物除外。一种替代条形码的搜索显示：内转录间隔区（ITS）和trnH–psbA基因间隔区的叶绿体具有很高的序列变异和种间差异，且在广泛的开花植物中容易扩增。此外，核酮糖二磷酸羧化酶大亚基和成熟酶K（matK基因）基因的叶绿体编码区已被发现是在基因测试中合适的DNA条形码，具有普遍性，高质量和序列覆盖率以及辨识度。因此，人们普遍认为，rbcL和matK区域可以作为标准的条形码，ITS和trnH-psbA区作为陆地植物的补充。使用这些标准的DNA条形码，中药药材及其混淆品的身份可以正确显示。在本综述中，我们讨论了使用这些标准的条形码和其他基于DNA序列的标记在识别药材中的使用，还提供了其当前应用的统计数据。

1.用DNA条形码鉴定药材

中药药材伪品可以来自密切相关的物种或其他族物种。因此，一个可以区分不同分类层次的基因序列的DNA条形码数据库是必要的，可以提供物种鉴别的参考序列。最近，我们已经建立了第一个在线的DNA条形码数据库，药材DNA条形码数据库，，供用户检索和分析药材的DNA序列。数据库共包含1300种药用植物（来自中华人民共和国药典和美国药典）约20 000个DNA序列，四种标准DNA条形码覆盖了药用植物超过50%的序列。ITS区是最经常被使用的（28%），其次是trnH–psbA（9%）、rbcL（8%）和matK基因（8%）区。DNA区域如叶绿体trnL–trnF基因间隔区和核5S rDNA间隔区的也是常用的基于DNA序列的标记。

1.1内转录间隔区

其区域包括ITS1基因间隔区、5.8S rDNA和ITS2基因间隔区（ITS1–5.8S–ITS2），大小为400到1000 bp以上。这是植物系统发育研究最常见的测序区，因为它具有高物种辨识度并且技术很易用。同样，它也是条形码和药材鉴定中最常用的区域。例如，在茜草科中的白花蛇舌草及相关属六个位点间，该区提供的信息最多，并具有最高的分辨率。该区域被成功地用于区分14种白花蛇舌草属植物，包括真正的抗肿瘤中药白花蛇舌草及其混淆品。低种内变异（lt; 0.5%）和高的种间变异（16%）使其适合于这2种植物的鉴别。利用基于这个条码的法医核苷酸序列信息（FINS）方法，我们发现在香港（中国）和波士顿（美国）市场销售的白花蛇舌草有七分之四被掺假。ITS区对于区分白花蛇舌草和来自其他族的伪品也是非常有用的，如漆姑草，雀舌草和无心菜，在石竹科和粟米草科物种中，共有103个信息位点多态性。尽管ITS区有高水平的变异和物种辨识度，但在某些情况下，ITS区的种间变异很低。例如，它不能区分许多乌头属的物种，其中包括.附子和草乌兰，这两种药材均被视为中药“乌头”记录在中华人民共和国药典上；ITS区也不能区分北柴胡（伞形科）和狭叶柴胡，二者都被视为“柴胡”，此外，该区不能区分这两种柴胡及其伪品；尽管狭叶柴胡是从北柴胡和其他七种柴胡物种中分离出来的，但ITS区域不能区分狭叶柴胡和大叶柴胡。

在其区域的ITS2间隔已被证明在55属48科药材的识别中很有效。ITS2区很容易在属的水平区分所有24种药用植物和66个相关的物种，也可以在物种水平区分80%的物种，应用ITS2区识别750属4800种植物，成功率达到92.7%。高变异和辨识度是其作为一种新的药用植物通用的的条形码强有力的论据，高种间变异和低种内变异是ITS区分辨密切相关物种的主要优势。例如，在豆科变异物种之间，ITS区显示平均1.7%的种内差异（范围从0%到14.4%）和平均8.6%的种间差异（范围从0% 到68%）；在鉴别石斛及其密切相关物种金钗石斛中，平均种间变异为12.4%，而种内变异约为1%。这些例子表明ITS2间隔区是一种识别植物和中草药的有力工具。

虽然ITS区和ITS2间隔区可以通过DNA测序帮助识别中药材，但由于多次复制和次生结构造成的病态序列数据问题，这些区域有时需要进行克隆。真菌污染是中药材中常见的问题，主要是由不正确的处理方法和存储造成。真菌的ITS序列容易用通用引物扩增，产生假阳性的PCR检测结果。为了克服这个问题，需要设计植物特异性引物。

1.2–psbA基因间隔序列

大多数开花植物的trnH–psbA区域大小在340和660 bp之间，在包括ITS、rbcL和matK在内的九个基因位点测试中，这一区域表现了最高的扩增成功率（100%）和鉴别率（83%），因此，这个间隔区是鉴定药用植物及其伪品的重要区域。例如，trnH–psbA基因区已被用来区分药用植物青蒿（菊科）、菌陈蒿及其伪品。此外，由于相对高的种间变异（从0.3%到2.3%）和种内变异（从0%到0.1%），该区域区分各种石斛品种是很有效的，因此TrnH-psbA区也被用来区分石斛（兰科石斛属）和金钗石斛，二者的序列差异范围为2%~3.1%。中药“重楼”的识别则进一步证明了trnH–psbA区的实用性。

TrnH–psbA区域技术的易用性及其区分物种的能力引起我们使用FINS的方法进行取证调查的注意。最近，我们使用trnH–psbA区识别镇咳药“马兜铃”（北马兜铃，马兜铃科）和它的替代品，在这项研究中，我们发现来自台湾和云南（中国）的两个马兜铃样本含有一个百合物种（百合科）作为替代，而广东和甘肃的（中国）的样本是真正的马兜铃。虽然trnH–psbA区识别许多草药品种是有用的，但它无法区分大红柑（芸香科）和其他几种柑橘属植物。TrnH–psbA基因区域的一个缺点是它不能产生双向明确的序列，聚A / T结构的存在降低了DNA测序的成功率，此外，在这个区域中经常发现核苷酸的插入和缺失，使得序列比对困难，以至于手动编辑序列顺序是第一选择。

1.3rbcL(大亚基核酮糖二磷酸羧化)

RbcL区是一个叶绿体基因编码区，在广泛的开花植物，裸子植物和隐花植物中，具有较高的扩增成功率，在七个位点的测试中具有较高的序列质量。然而，在辨别茄科两物种颠茄和烟草的11种条形码位点检测中，rbcL区域表现出最低的变异（0.83%）。低种间变异也存在于其他药材及其混淆品之间，例如，在“射干”（射干属，鸢尾科）和其伪品（鸢尾属，鸢尾科）中有0~12个核苷酸的差异。在“甘草”（七甘草属）的1374 bp的序列中，rbcL区域有21个信息位点。与其伪品相比，蕨类植物中草药“绵马贯众”（鳞毛蕨科）在rbcL区显示19个单核苷酸多态性。RbcL区基因的低变异是鉴定来自密切相关物种的药材的一个主要障碍。有趣的是，利用rbcL区与trnH–psbA区的组合，可产生最高物种识别率，因此，可以作为物种识别的重要工具。

1.4成熟酶K

在叶绿体中，matK基因编码区是一个发展最为迅速的区域，在被子植物中，表现出较高水平的物种辨识度。由于相当大的种间与种内变异，该区域成功鉴定了中药“大黄”（来源于掌叶大黄，蓼科）与相关大黄属物种。由于高变异，matK基因区域通常被用于识别不同产地的药材，例如，matK基因区域能够识别“何首乌”（何首乌属，蓼科）和“蛇床”（蛇床子属，居松南五味子属，伞形科）的不同地理来源。此外，在中国和日本，matK基因区域还被用于评价“川芎”（川芎属，伞形科）的物种起源。MatK基因区域的差异足以区分“三七”（三七属，五加科）的不同地理来源及起源，但它不能区分不同品种的三七。虽然matK区域在确定药用植物的品种和产地时非常有用，但在某些植物种群中，如隐花植物，matK区域基因扩增和测序的成功率令人很不满意，而且，进行扩增所用引物的通用性需要改善。

1.5其他基于DNA序列的标记

除了标准的DNA条形码，许多DNA序列也已被用于中药药材鉴定，包括叶绿体trnL–trnF基因间隔区和核5S rDNA间隔区。

最近，我们用trnL–trnF基因间隔区鉴定了药材“马兜铃”的种类。在这项研究中，我们发现trnL–trnF 区域能够把大百合（百合科）从其变异大百合变种和密切相关的物种中分离出来。利用FINS方法的取证调查显示，马兜铃替代品来自于云南大百合变种。在其他情况下，trnL-trnF基因间隔区区分物种或许是合适的。例如，该区域被用来区分“苍术”（来自北苍术，菊科）和茅苍术（来自有关苍术物种）。此外，用该区域不能很好地区分中药“繁露”（繁缕属，石竹科），“肉桂”（肉桂属，樟科）及与它们相关的物种。

5S rDNA间隔区是一种常用的中草药药材鉴定区，具有很大的可变性。在中药“茵陈”（川西獐牙菜菇）及其伪品（来自其他獐牙菜属物种）中，5S rDNA表现出31%~65%的种间变异。5S rDNA间隔区还可以识别各种“木香”和药用淫羊藿属植物（小檗科）。此外，我们使用这个区域来验证“雷公滕”（来自卫矛科雷公藤属）并解决雷公藤属物种的分类问题。利用基于5S rDNA间隔区的FINS方法分析，三个样品的雷公藤是道地药材，但其中两样品掺杂一些苦皮藤（卫矛科）或粉背南蛇藤。虽然5S rDNA间隔区存在着高变异性和辨识度，但根据我们的经验，该区存在多次复制的重要问题，因此在大多数情况下，需要进行分子克隆。另外，高种间变异与种内变异包括许多核苷酸插入与缺失，使得序列比对困难，这些因素使5S rDNA间隔区不太可能作为一种标准DNA条形码。

2.DNA条形码的展望

中药药材的分子鉴定已经进行了超过十年，它的优点是公认的，而且它已被列入中华人民共和国药典，其在线补充说明2作为识别一些传统中药如“川贝母”（川贝母属，百合科）、“乌梢蛇”（乌梢蛇属）和“蕲蛇”（蝮蛇属，蝮蛇科）的标准方法。在未来，DNA条形码和其他基于DNA序列的标记在分子检测中将很可能有一个广泛的应用。植物分类学家和系统学家可以使用这些标记来促进物种识别和监测中药资源；研发单位和制药行业将能够准确识别中药材，以保证其安全性、有效性、质量得到控制；法医科学家可以使用FINS的方法（利用DNA条形码和分支系统学分析），在法医学应用中揭示未知的材料或确认疑似物种。近年来，我们做了相当大的努力去为特定的植物搜索合适的DNA条形码，这项工作仍在进行，因为目前对于不同科物种，用于区分的DNA条形码不同，即这些条形码都不是普遍适用的。

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