遵循综合多国指导方针的MRM-MS分析验证门户网站

摘 要

多反应监测-质谱法成为定量蛋白质组学的主流方法，这使得方法的验证和分析的数据变得重要。在这个 MRM-MS 检测验证门户中，我们开发了一个网站，该网站根据欧洲药品管理局、美国食品药品监督管理局和韩国食品药品监督管理局的生物标志物检测指南自动评估上传的 MRM-MS 数据。该门户读取Skyline 输出文件并根据每个独立机构的标准生成以下结果——校准曲线、特异性、灵敏度、交叉污染、精密度、回收率、基质效应、回收率、稀释完整性、稳定性和 QC。与 11 个评估类别相关的最终表格和数据显示在单独的页面中。使用Spring Boot作为网页开发的框架，遵循MVC模式。JSP、HTML、XML和Java Script用于开发网页。服务器由Apache Tomcat、MySQL 组成。输入文件是来自天际线的输出文件（csv 文件），每个文件按特定列按顺序组织。SQL、JAVA 互通以评估所有类别并显示结果。方法验证门户可以通过任何类型的资源管理器访问https://pnbvalid.snu.ac.kr。

第一章 绪论

生物标志物有助于疾病的检测和管理^[1]。尽管有许多出版物、新技术和充足的资金，但很少有生物标志物能够进入临床实践。这种现象可以部分归因于缺乏一个明确和可访问的路径来验证临床使用的候选生物标志物^[2]。

由于生物标志物的特性各不相同，并进行了相应的评估，因此有必要使用多种标准和方法来验证生物标志物测定^[3-4]。例如，通常使用定量免疫测定法检测基于血液蛋白的生物标志物。相比之下，组织中基于蛋白质的生物标志物和基于 DNA 的生物标志物通常分别使用免疫组织化学和原位杂交测定^[5]进行测量。在过去的十年中，基于 mRNA 的生物标志物已经使用微阵列进行了研究^[6]。

无论类型如何，生物标志物测定必须在临床使用之前进行分析验证。分析方法验证涉及确认生物标志物测定和整体方法的准确性、精密度、特异性、稳健性和稳定性^[3,7,8,9,10]。其他测定验证标准包括线性、平行性、分析物添加后的恢复和功能灵敏度。

多反应监测质谱 (MRM-MS) 测定适用于测量临床应用中的多标志物组^[11-14]。MRM-MS 分析可以准确量化多种生物标志物。然而，同时测量与多标志物定量值相对应的数千个转换的 MRM-MS 测定的分析验证可能既困难又费力，尤其是在手动执行大量程序和类别的解释和评估时。

目前，MRM-MS 数据可以部分使用供应商特定的软件（例如，MassHunter 定量分析，Agilent；MultiQuant，ABSciex；Pinpoint，Thermo Scientific）或供应商独立的程序，例如 Skyline 进行处理^[15,16]。总体而言，这些软件程序通常用于对质谱数据和离子对进行初步分析，还允许用户验证和编辑峰选择/积分。质量-SIS , 是一个软件程序，用于自动生成肽标准曲线并根据 MRM 数据计算分析属性，例如定量限和动态范围，符合美国食品和药物管理局 (FDA) 的指导方针^[17]。虽然它为几个标准提供了直观的结果，但它并不适用于 FDA 指南中的所有类别，也不适用于 EMA 或 KFDA 的那些。这些软件程序都没有提供深入了解给定 MRM-MS 测定中检测到的转换的分析验证的功能。

MRM-MS 测定需要分析验证来测量临床环境中的单个或多个生物标志物。然而，在 MRM-MS 测定的分析验证中会遇到限制。为了应对这一挑战，我们开发并推出了一个名为M-MVP（MRM-MS 分析-分析方法验证门户，https://pnbvalid.snu.ac.kr）的分析门户，作为免费工具M-MVP 旨在自动评估MRM-MS 检测数据。M-MVP中配置的方法验证项旨在满足三套指南[美国食品药品监督管理局 (FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和韩国食品药品监督管理局 (KFDA)] 的要求，见图1。

图1 M-MVP 主页的快照，用于 MRM-MS 测定的简单和高级分析方法验证。

使用 M-MVP可以轻松评估各种分析验证程序。M-MVP集中了所有方法验证计算，从而显着减少了手动处理可能发生的时间、精力和错误。这些优势通过简化多标志物组合检测的分析验证，促进了MRM-MS检测在临床环境中的实施。

第二章 实验结果

方法验证的主要目的是测试研究人员提出的用于确定特定生物基质中一种或多种分析物浓度的方法的可靠性。为了使该方法被认为具有可重复性和可靠性，FDA、EMA 和 kFDA 制定了 11 项标准——其中一些已在各主管部门实施——必须满足这些标准才能进行验证。类别包括：校准曲线、特异性、灵敏度、残留、精密度、准确度、基质效应、回收率、稀释完整性、稳定性和质量控制 (QC)。

需要检查校准曲线以显示研究中可预期的测定定量范围的线性。该方法的特异性要求目标分析物和内标能够与基质中的内源性成分有把握地区分开来。每种分析物的校准曲线的定量下限 (LLOQ) 定义了方法的灵敏度。验证残留可确保如果测量基质中的高浓度分析物，后续批次的数据不会受到影响。不言自明的精密度和准确度通过评估分析物的重复单个测量值的接近度以及观察值与标称值的接近度来验证该方法。基质效应是使用 LC-MS 执行方法时要考虑的关键因素，因为离子抑制或增强可能会在实验过程中发生并影响结果。该方法的回收率需要优化以确保分析物的提取是有效和可重现的。稀释完整性确保稀释基质或分析物不会影响准确度或精密度。稳定性决定了基质中的分析物在处理和储存过程中是否稳定。最后，QC 评估方法的性能和目标分析物的稳定性。稳定性决定了基质中的分析物在处理和储存过程中是否稳定。最后，QC 评估方法的性能和目标分析物的稳定性。稳定性决定了基质中的分析物在处理和储存过程中是否稳定。最后，QC评估方法的性能和目标分析物的稳定性。

我们之前的研究和补充信息中详细介绍了这些方法和测定。对于每个类别，监管机构都规定了通过标准的条件，门户网站会自动从上传的数据中计算出每个类别对应的所需值，并将计算值和评估结果显示在各个页面上^[18]。

结果页面分为两部分：计算和方法评估页面,见图2。

图2 M-MVP的概述。M-MVP分为三类。第一类（用户过程）包括登录、选择实验信息、上传数据、填写预期浓度和选择线性范围。在第二类（计算过程）中，11个类别被自动计算并以表格形式提供下载。最后，第三类（方法评估过程）自动评估计算结果是否通过了特定国家指南中规定的标准。

对于计算页面，计算结果以表格形式显示，其中肽段序列、片段、产物电荷和重复名称设置为默认列描述。如果类别需要，则会显示计算值，例如平均峰面积比 (PAR) 和标准偏差，见图 3。在表中，结果以列表形式显示，共 10 行，最多 100 行。为了保存结果供个人使用，M-MVP 支持将表格下载为 csv 文件。

图3 校准曲线结果页。校准曲线、特异性、灵敏度、携带量、质量控制、精密度、准确度、基质效应、回收率、稀释完整性和稳定性的计算结果分别以表格形式显示在各个页面。蛋白质名称、多肽序列、片段离子、产品电荷、复制体名称以及与验证标准相对应的结果都显示出来。

对于方法评估页面，当用户请求计算页面时，服务器将评估当前类别是否通过三个监管机构（FDA、EMA 和 KFDA）的性能规范，然后将结果与上传的数据一起存储。用户必须检查每个类别以确定某个类别的 M-MVP 结果是否满足指定的准则。在检查所有11 个类别后，如果监管机构没有指定某个标准，用户可以通过显示“通过”或“未通过”或“未解决”来检查这些类别是否通过了性能规范和验证实践，见图4。评估是根据所有 3 个监管机构的指南进行的，结果显示在一个表格中。当有1个或多个类别未通过评估时，用户必须在实验中修改相关类别，然后上传修改后的csv文件。

图4 方法评价结果。审定结果显示在一个页面上。对于每个类别，该表将显示它是否通过了3个管理机构的验证标准。如果没有一个管理机构对某一特定类别有规定，则显示 '未处理'。(A) 校准曲线，(B) 特异性，(C) 灵敏度，(D) 携带率，(E) 精度，(F) 准确度，(G) 基质效应，(H) 回收率，(I) 稀释完整性，(J) 稳定性，和(K) 质量控制验证结果显示如上。用户可以为未通过标准的类别重新上传其数据文件。

在工作服务器上设计 M-MVP 时，主要优先事项之一是为 AFP-L3 实施 MRM-MS 测定，AFP-L3 是众所周知的肝细胞癌诊断生物标志物^[18]。作为一个工作示例，M-MVP 的分析方法使用来自先前测定实验的数据进行了验证，因为所有类别的方法验证实验都已针对该测定进行过，并且已经使用来自 3 个管理部门的标准进行了验证。

利用 Skyline 11 个类别的输出数据，我们开发并测试了 M-MVP 的性能。类别的性能规范和验证实践体现在 M-MVP 中，并在结果表中表示，其中输入数据的格式和指南详细信息已从为先前研究创建的补充表中采用^[18]. 此外，将 M-MVP 执行的计算的性能规格与使用 Excel 的手动方法与相同数据的性能规格进行了比较。M-MVP 计算与 Excel 值一致，小数点后 4 位，此时差异微不足道。在性能和验证所需的时间方面，M-MVP 瞬时完成所有类别，而 Excel 中的手动计算和验证过程需要几个小时。MRM-MS AFP-L3 检测的 11 个类别的所有数据都在“教程”选项卡中，用户可以在其中访问它们以进行自我教育（补充信息）。

讨论

我们开发了 M-MVP，用于使用 Skyline 数据验证 MRM-MS 测定。作为在线化验门户，计算在服务器端进行，降低了用户的计算负担。我们的门户旨在支持 MRM-MS 检测的分析验证。M-MVP 对于处理大量 MRM-MS 数据特别有效，例如使用多标记面板分析生成的数据。

有几个问题需要进一步发展。例如，当前构建对命名参数很敏感，并且要求数据集遵循 Skyline 生成的 .csv 文件的命名约定。因此，用户必须确保上传的文件具有 M-MVP 要求的正确命名格式。开发灵活的命名功能可能会减少用户的学习曲线。

将 M-MVP 整合到 Skyline 的外部工具中是另一个可行的开发选择。在 Skyline 的外部工具中实施 M-MVP 的核心功能将大大减少验证 MRM-MS 分析所需的时间，因为该过程将立即在 Skyline 上运行。即使 M-MVP 作为 Skyline 中的一种外部工具，需要用户提供更多的计算能力，但人们可能宁愿不必将文件从 Skyline 移动到我们的门户网站，而是可以在本地计算机上执行整个过程。这一过程最终将导致 MRM-MS 分析的分析方法验证过程自动化。

质谱灵敏度和选择性的快速进步将导致基于 MRM-MS 的多标记分析的成功开发。开发 M-MVP 的主要目的是促进将基于 MRM-MS 的多标志物检测引入商业领域。自然，化验开发过程必须遵守多国准则。我们希望 M-MVP 能够通过降低临床准入门槛来加速 MRM-MS 检测在临床应用中的实施。lt;

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