膜生物反应器：一种新的以游离细胞方式培养厌氧氨氧化菌的工具外文翻译资料

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膜生物反应器：一种新的以游离细胞方式培养厌氧氨氧化菌的工具

摘要

在膜生物反应器中，厌氧氨氧化菌快速生长，污泥龄仅需12天。这种相对短暂的污泥龄使厌氧氨氧化菌富含97.6%的纯度。在稳定的、专用的培养环境中缺乏选择性压力使得它们作为游离细胞生长在悬浮液中且没有絮状物和颗粒的产生。快速的生长、低的钙镁浓度以及可能存在的酵母抽提物和低的剪应力对于获得存在游离的厌氧氨氧化细胞的培养物十分重要。在培养过程中，发现了“Candidatus Brocadia”种属向“Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”种属的群体变化。人们猜测这种转变是由于Kuenenia属细菌对亚硝酸盐的亲和性更高。在膜生物反应器上可以进行高效率、高纯度的厌氧氨氧化菌悬浮液的培养，使其成为一种研究厌氧氨氧化菌的有力工具。

关键词：厌氧氨氧化菌、厌氧氨氧化、缺氧氨氧化、Kuenenia属、 Brocadia属、膜生物反应器、培养方式、选择性压力、游离细胞

前沿

培养缓慢生长的微生物时，需要维持生物量，且大部分依赖于微生物形成生物膜或者聚集体例如：絮状物或颗粒。这些反应由于生物量不足而受阻，如果微生物生长缓慢，小部分的生物量通过出水不断丢失，可能会使观察到的倍增时间更长。基于颗粒污泥反应器的设计，使得聚集反应堆兼有短暂的水力停留时间和较长的污泥龄。在高容积负荷率反应器中，采用缓慢生长的生物体，如在硝化，厌氧消化，亚铁离子氧化和磷酸盐去除的过程中，以小规模或是大规模都可以成功地实施。这种反应器普遍的例子有：气升式反应器、内循环反应器、升流式厌氧污泥床。

尽管基于颗粒污泥的生物反应器对于培养缓慢生长的微生物有利，但是从科技价值角度来看，产出的颗粒并不适合学习这些微生物。由于絮状物和微粒本身的扩散限度，生物学运动参数例如：底物亲和力、最大生长速率、维修需要，不能得到很好的评估。执行破坏程序是为了在微生物实验中获得单独的细胞例如：最大或然数（MPN）和荧光原位杂交（FISH），在获得到的结果中，需要大量的生物量和引入偏差。同样，细菌所需要的用来凝聚的能量（例如：附加的细胞外的聚合物）可能会减少最大特定生长速率mu;m和凝聚物，因此可能会低估最大特定生长速率值mu;m。

在膜生物反应器中，生物量并不决定于生物量的沉淀物。通过对微生物细胞不渗透的膜，污水会被隔离。与包含颗粒生反应器不同的是，膜生物反应器需要培养有着充足生物量但在沉降能力上没有选择的缓慢生长的微生物。这种反应器的类型现在被广泛应用于动物/植物类的敏感细胞和细胞组织产物。膜生物反应器同样应用于大规模的污水处理中，且膜分离减少了絮凝污泥的表面积。

在这次研究中，我们证明了在膜生物反应器中以高纯度和生产效率培养缓慢生长的厌氧氨氧化菌的可能性。厌氧氨氧化是铵和亚硝酸盐的生物转化为分子氮气体的过程并由缓慢生长、交错丛生的浮霉菌进行。厌氧氨氧化菌是自养菌，相于其他细菌它有着天重复时间的低增长速率。尽管我们对他们培养相当感兴趣，只有富集（普遍包含60%—80%的厌氧氨氧化菌）才能黏附在凝聚物或生物膜上。这也许甚至会致使人们觉得厌氧氨氧化菌优先生长在生物膜或颗粒上。通过有效观察，生物膜在颗粒污泥/生物膜反应器中选择性生长经常伴有较好的生物量的观点被加强。然而，在几个海洋系统的好氧—缺氧界面中，大量游离的厌氧氨氧化菌表明游离细胞的生长也是一种自然的生长模式。

厌氧氨氧化的过程被大规模的应用于生物膜反应器。在厌氧氨氧化菌的研究中，不同于反应器相关的问题，在厌氧氨氧化菌脱氮处理中，这种反应器更优于膜生物反应器。自从厌氧氨氧化菌构成污泥颗粒或生物膜，在反应器中便形成了一种简单的、经济的方法以获得高生物量浓度。然而，污水总是包含一定数量的悬浮固体。自从这些悬浮固体（无意但有效地）被膜过滤截阻并且因为厌氧氨氧化菌生物量产量相当低（由于他们是自养型），活性污泥同样被期望在厌氧氨氧化过程的膜生物反应器中快速减少。

在这次研究中，缓慢生长的厌氧氨氧化菌在小规模的膜生物反应器中达到高纯度。在超过9个月的时间里，高产量完全悬浮的厌氧氨氧化菌使得反应器成为了一种对于研究厌氧氨氧化过程的有力工具。

材料与方法

膜生物反应器的接种

Rotterdam的Dokhaven-Sluisjesdijk污水处理厂里，这种反应器被接种在全面厌氧反应器更低区域底部的厌氧污泥颗粒里。在移除了20%最重（最快安置）部分的固体后（包含高沉淀物含量），反应器被接种在剩余1.5L的生物质颗粒。

反应器操作

一个15L的反应器用作培养（如图一）。其中有8L的液体体积并且每天向反应器中投入3.9—4.1L不同组份的媒介，由此导致了两天的水力停留时间。通过反应器中调节液位的Zeeweed型污水泵连接膜微细过滤模块，液位被保持。膜纤维（大概小孔尺寸:0.1微米）被用于污水处理的膜生物反应器中且不渗透于微生物细胞。用过的小规模模块包括100根管子（直径1mm，长度300mm）,模块每10天被替换以阻止膜表面生物膜的生长，随后被蛋白酶清洁剂清除（在反应器之外）。用清水清理后，清除所有清洁剂。膜的替换仅需要1—2分钟，在替换过程中，停止混合以避免大量的空气进入到反应器中。

为维持缺氧状态并提供缓冲能力，反应器以25ml/min的速度喷射95%Ar和5%CO₂。酸碱度维持在7.1—7.5之间。温度控制在38℃，并且搅拌的速度达到160rpm。为避免生长光营养有机物（以及需要硝化细菌这样非厌氧氨氧化菌产生的相关氧化产物）。这种反应器被PVC材料完全覆盖（1mm厚度）以阻止光渗透。根据Van de Graaf等人的研究，这种反应器被放入了一种浓缩的媒介，其中包含120mm铵和120mm的亚硝酸盐。

在开启的第一周里，供应100mm固体亚硝酸盐以避免硫酸盐减少。在这一周里，流入的铵、亚硝酸盐水平分三个阶段缓慢从20mm增长到120mm。然后，经过30天完整的生物量（特别是极大的污泥龄），每天用污泥泵从反应器中移除0.5L，污泥龄被控制在16天，但是这个泵可以直接抽出反应器悬浮液。这种污泥泵的操作是电脑控制的，当污泥龄在第16天里开始被控制时，从这里指定为实验的第一天。

在第85天，亚硝酸盐不完整的转化后，媒介的成分得到调整。在媒介中钙和镁的水平降低了75%且开始添加1mg/L的酵母抽提物。在第127天时，污泥龄减少到12天。再过100天污泥龄为维持。从150天开始，厌氧氨氧化菌从120mm被降低到100mm，以减少反应器中过量的厌氧氨氧化细菌。该反应器被操作超过250天。

亚硝酸盐、硝酸盐、铵、一氧化二氮、一氧化氮的测定

人们使用Dr.Lange试剂盒分析和设计的分光光度计来测定铵（0.14-3.4mm）、亚硝酸盐（1.1-43微米）、硝酸盐（16-964微米）。废气放置在1L的试样袋中，每20分钟被收集并用化学发光分析器测定这个袋子中的NO。用气体色谱分析法随机测定NO₂，100mu;g的废气样本被直接注入安捷伦气相色谱填充柱。NO₂被以低于2ppm的界限用电子俘获检测器测定。

利用分子方法进行群落分析

荧光原位杂交

Pernthaler等人描述的试样被固定用于荧光原位杂交。简单的来说，细胞被洗净、固定在多聚甲醛中并涂上聚四氟乙烯涂层。脱水之后，细胞被杂交成以下低聚核苷酸荧光标签探针：EUB-338、Pla-46、AMX-368、AMX-820或KSI-157。目标有机物的详情和序列可以见表格2中。人们用Zeiss Axioplan 荧光显微镜进行显微观察。固定发生在第35、64、77、149、196和267天。在第267天，富集水平可通过在显微镜下计数可见细胞进行估计，但是并没有和AMX-820探针杂交（非厌氧氨氧化细胞的数量）。这些数量被当作全部可见（厌氧氨氧化细菌和非厌氧氨氧化细菌）细胞的数量。

提取DNA、放大PCR和系统分析

（在17和118天时）在反应器中提取样品（5ml细胞悬浮液），直接离心5分钟达到13000克。细胞团块被储存在20℃。根据厂商协议，使用超净土壤DNA提取试剂盒从细胞中提取基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析提取DNA。

随后，人们使用Pla-46F、907RM、1392R（详看表2）提取出的DNA扩大几乎完整的16SrRNA基因。用琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链式反应产物，用Qiaquick PCR纯化试剂盒提纯并被按序列排好。这种序列第一次用blastn算法计算并当作基因库的顺序存储。从那时以后，他们同ABR软件程序被输入了席尔瓦数据库。对这些序列进行校正，在宗谱被创造后，以Felsenstein校正使用邻接算法。几乎完整的16SrRNA序列被放到基因库数据库加入序号EU361730号。

结果

一般反应器操作

接种后的四个星期内，反应器可以在至少0.8kgNO₂--N/m³的速率下操作。通过试验，反应器可以在亚硝酸盐的极限下被操作且亚硝酸盐普遍被消耗完全（ge;99%）。接种的颗粒在最初的60-65天里变成了一些絮状物。在媒介中，钙镁水平降低，酵母抽提物的加入，致使絮状体消失以及培养成分变成红色的悬浮游离细胞。移除的污泥不再产生沉淀。在出水容器中（不搅拌、停留时间2.5天），大量在悬浮液中生物量剩余物，经过几个星期的操作仅有一部分生物量积累在浮游层。

膜生物反应器可以被稳定操作超过250天，并把污泥龄小范围维持在12天和16天。在一个12天污泥龄的操作中相应地可以达到的有效生长速率达每小时0.0026和0.0035，这是第11天和8.3天含量的两倍。随机测定12个小时污泥龄里的最大转换能力，其值增加到1—2小时能力测定值，但并非所有的亚硝酸盐都被转化。因此，可以观察到亚硝酸盐缓慢的积累。施加亚硝酸盐负荷率以减少亚硝酸盐的积累量，亚硝酸盐的转化速率在无亚硝酸盐限制的条件下，可被估计且在常规操作条件下与转化速率有关。这些实验表明反应器在70%-90%最大转换速率下被操作。操作条件与不同方法无关。亚硝酸盐：铵的转换比率达1.1-1.3且硝酸盐：铵的比率达0.1-0.25。这些数据与其他反应器相一致，联机测定一氧化氮在膜生物反应器废气中的量，其水平普遍低于1ppm。（脱机后）N₂O水平低于2ppm。因此，氮的成分转化成的NO和N₂O低于0.01%的氮转化物。

膜污染在最初60天的操作中不断加重，但在使用预定的替换物（每10天）前不会导致膜的阻塞。在最初的120天内，膜替代物在转化中不会产生阻塞。但在此之后，转化只有延迟了1小时后才能再一遍开始。很有可能是在120天稳定的操作中缺少非自养的有机物和硝化细菌，从而增加了程序中被要求移除的氧气泄露到反应器中的时间。因此，禁止短暂的厌氧氨氧化过程。在富含铵的好氧试验中，底物移除氧气能力的不足同样可见。在这些批量试验中，氧气浓度低于0.1mg/L/h，所以不能检测到氧气的消耗。

微生物群落分析

在培养液中厌氧氨氧化菌包括Candidatus 'Brocadia'属。从第35天杂交发生后，用“Kuenenia/Brocadia”特定的探针（AMX-820）检测到这仍是主要群落，而并非用Kuenenia特定的探针。然而，样本在第64天显示大量'Kuenenia'属细胞，它在第149天之后变成了主要的群落。在这些天后，主要的群落不会发生改变且 'Brocadia'属不能再被检测到(lt;0.5%)。在最初的一些天到100天后，对于90%的时间里，这种水平的富集从60%增加到80%。在任何时间里，没有发现任何细胞与“Kuenenia/Brocadia”特定的探针（AMX-820）杂交，但是在样本中，它们会和浮霉菌特定的PLA-46探针和所有铵特定的AMX-368探针杂交。这表明其他描述的厌氧氨氧化细菌没有显现（或以很低的数量显现）。自从获得游离细胞，人们量化使用荧光原位杂交可以观察到每个单细胞以及测定是否这种细胞已经和“Kuenenia/Brocadia”特定的探针（AMX-820）杂交。在第267天，富集的水平达到97.6%plusmn;0.2%。

种群从Candidatus 'Brocadia'属变成Candidatus 'Kuenenia'属被16SrRNA序列分析证实。样品的序列在第17天显示和Candidatus 'Brocadia'属有较好的相似度。样品在第118天显示序列与Candidatus 'Kuenenia'属相似度100%并且与原Candidatus 'Kuenenia'属有99.7%的相似度。数据3显示系统数基于16SrRNA系列。

亚硝酸盐的亲和力

在反应器中的亚硝酸盐的水平有一定的波动但普遍在2-6微米。自从反应器在以最大特定转化率的70%-90%下运行时，最大的渗透常数必须在10%~50%范围内。并且因此可能在0.2~0.3微米。低水平亚硝酸盐是另一个指标，由于扩散限制，任何显著的聚集物可能导致更低的底物亲和力，细菌表现为游离细胞。

讨论

为什们可以获得悬浮培养？

虽然聚集体的获得是富集反应器逻辑序列的结果，这取决于沉淀的能力（像是SBR、气升式反应器），但反过来说不一定正确。因此，在沉淀能力没有选择的浓缩系统（像是膜生

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