通过添加还原石墨烯氧化物快速启动厌氧氨氧化工艺外文翻译资料

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通过添加还原石墨烯氧化物快速启动厌氧氨氧化工艺

摘要

在本研究中，建立了两个上流式塔反应器，以研究还原氧化石墨烯（RGO）对氨氮氧化工艺启动的影响。实验表明，添加RGO的氨氧还原工艺的启动期可以从67天缩短到49天。进一步的研究证明，添加了RGO的厌氧反应器具有相对较高的厌氧细菌活性和更强的稳定性，甚至对高氮负荷率（NLR）的影响也具有更强的稳定性。后220天的培养，R2的除氮速率（RGO添加）达到1.08times;10 ³ g-N/（m ³ d），这比R1（对照）的0.846times;103g-N /（m³ d）高27.4％。肼脱氢酶（HDH）活性显着增加，这可能是快速厌氧启动的触发因素。与对照反应器相比，通过定量PCR和荧光原位交分析，在整个操作期间R2中的厌氧细菌数量增加。

介绍

自从20世纪90年代初在脱氮流化床反应器中发现厌氧氨氧化（anamox）以来，氨氧还原相关技术已经迅速发展，并成为处理高氨浓度和低COD含量的有前途的生物工艺 年[1]。 与常规硝化反硝化过程相比，厌氧氧化工艺具有更强大的优势，如无需氧气和有机碳，低污泥产量和减少二氧化碳或氧化亚氮排放[2]。 因此，厌氧氨氧化工艺被认为是一种可持续的生物除氮技术。

虽然已经进行了一些关于实验室规模甚至全面的厌氧氨氧化工艺的研究，但实现迅速富集厌氧细菌仍然具有挑战性，由于其相对缓慢的生长速度，其倍增时间从11到20天[3]。 第一台全规模厌氧氨氧化反应器的启动耗时近三年[4]，这表明迫切需要为厌氧氨氧化工艺寻求更快的启动策略。 在过去几年中，缩短启动期的努力通常旨在选择合适的反应器类型[5,6]，尝试不同种类的种子污泥，并使用不同类型的载体[7,8] 来显示出他们自己的缺点和优点。 此外，提高厌氧细菌的活性和进一步加速细胞生长是缩短厌氧氨氧化工艺的启动期的另一种方式。

石墨烯氧化物（GOs）由于在其基底平面和边缘具有环氧化物，羧基和羟基的层状和氧化的片层，在微生物学中引起了广泛的注意[9]。在这些材料中有一些非凡的特性，如大的表面积，优良的胶体性质和低细胞毒性[10]。更重要的是，实验发现还原氧化石墨烯（RGO）的电子转移能力比GO大约高三个数量级。 Ruizetal [11]表明RGO涂层过滤器可以诱导大肠杆菌的更快的生长。此外，以前的研究已经表明，RGO可以从具有复合生物质的GO中减少[12]。此外，Wangetal[13]报道，添加75毫克/升RGO可以提高厌氧氧化生物量的总氮（TN）10.2％的去除率，虽然促进机制没有解释。此外，Yin等人[12]证实，添加RGO测试了厌氧氨氧化生物质促进了17.2％的TN去除率和1.5-2倍的酶活性的增强。因此，合理推测通过连续培养添RGO可以增加厌氧细胞数量，使得厌氧氧化工艺快速启动。到目前为止，关于从含有RGO的活性污泥中开始厌氧氨氧化工艺的研究从未有报道。

因此，本研究的主要目的是：（1）验证通过适当的RGO添加（剂量为100mg / L）以快速启动厌氧氨氧化反应器的可能性（2）评价RGO对厌氧细菌数量和酶活性的影响。

2.材料与方法

2.1.微生物和饲料培养基

将来自陵水污水处理厂（中国大连）的活性污泥接种在两个上流式塔反应器中。 播种污泥在两个反应器中具有约4960mg / L的最终混合液挥发性悬浮固体（MLVSS）浓度。 微量矿物质介质的组成由van der Graaf [14]描述。厌氧氨氧化菌的培养基为（NH4）2SO4、亚硝酸钠、碳酸氢钾（500毫克／L）、磷酸二氢钾（27 mg/L），MgSO4·2H2O（300 mg/L）和CaCl2·2H2O（180毫克/升）。

2.2.连续试验

两个相同的流化床柱式反应器R1（对照反应器，无RGO添加）和R2（添加100mg / L RGO）用于连续实验。工作体积为约0.3L，内径为5cm，高度为15cm。两个反应器含有30g（湿重）种子活性污泥，导致每个反应器的初始MLVSS浓度为4960mg / L。与R1不同，30mg GO与种子污泥均匀混合，然后加入反应器R2中。最佳剂量为100 mg / L，由先前的研究[12]确定。在反应器启动的开始，原始NH -N和NO _2- N剂量分别为50mg / L和65mg / L。主动水力停留时间（HRT）为6小时，对应于氮负荷速率（NLR）为460g-N /（m³ d）。用相同的介质连续进料两个反应器，并且用99.5％N ₂吹扫流体以保持溶解氧（DO）低于0.5mg / L。通过加入2M HCl将流动pH调节至7.0plusmn;0.2，并使用水浴将温度保持在35plusmn;1℃。图1示出了连续实验的示意图。

2.3. 分析方法

使用具有IonPac AS18阴离子柱的离子交换色谱（ICS-1100，DIONEX，AR，USA）测定亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。 在检测之前，所有样品必须用0.22 lm孔径的膜过滤。 测量的pH使用数字pH计（PHS-25，Leici Company，China）进行，而DO通过数字DO计（YSI，Model 55，USA）测量。 根据标准方法[15]测量NH -N和MLVSS浓度。

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图1.相同的厌氧氨氧化反应器示意图

2.4. FISH检测

在第0天和第200天从反应器R1，R2获取用于荧光原位杂交（FISH）分析的厌氧生物质样品。根据Duan等人描述的方法进行FISH分析[16]。在反应器中使用异硫氰酸荧光素（FITC）的Amx820探针（5-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3）和4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行FISH测定以显现厌氧细菌数量的变化。探针购自TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd。（日本）。将污泥样品在4℃在4％多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水中固定24小时。将固定的细胞（约5mu;L）点在明胶包被的载玻片上，并在无菌室温空间中干燥。在46℃下进行杂交2小时。杂交后，通过用包含与杂交缓冲液相同组分（除了探针）的洗涤缓冲液冲洗除去未结合的寡核苷酸。然后，用DAPI另外染色样品以检测总细菌。用Olympus倒置显微镜（Olympus ZX71，Japan）检查载玻片，然后使用数码相机（Nikon D7000，Nikon Corporation，Japan）拍摄载玻片的数字图像。 Image Pro-Plus软件用于FISH分析。

2.5. 生物质提取物的制备及酶活性测定

首先，将取自每个反应器的厌氧生物质样品在4℃以8,000rpm离心20分钟。其次，除去上清液后称重2g细胞（湿重），然后用磷酸钠缓冲液（20mM，pH7.0）洗涤两次。第三，将洗涤过的丸粒重悬于20ml相同的缓冲液中，并通过冷冻和解冻随后通过超声（225W，在4℃下30分钟，超声波处理（CPX 750，USA）裂解。最后，通过在4℃下离心（22,000rpm）30分钟分离细胞碎片。将上清液储存在4℃，并在测定蛋白质和酶活性中用作细胞提取物。蛋白质浓度根据Bradford方法[17]测定，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准。根据Shimamura等人描述的方法测定肼脱氢酶活性（HDH）[18]，并且使用分光光度计（V-560UV / VIS分光光度计，Jasco，日本）细胞色素c在550nm处的吸光度的增加体现了标准混合物中的反应。 HDH活性表示形式为1mol细胞色素c减少/ mg蛋白/ min。

2.6. 定量PCR（qPCR）检测

厌氧细菌的实时PCR定量使用Amx 809-F和Amx 1066-R作为引物对。 25mu;L的反应体积含有12.5mu;LSYBR ^@ Premix Ex Taq TM（TaKaRa，大连，中国），0.4mg / mL BSA，0.5mu;LRox参考染料，以每种引物的200nm末端浓度和2mu;L提取的DNA作为模板。对每个样品分析三次重复。 PCR程序如下：在95℃变性2分钟，然后在95℃变性5秒，在62℃退火30秒，在72℃退火30秒。通过熔解曲线分析显示在Tm = 87.0℃仅有一个峰。没有观察到与引物二聚体假象相关的可检测峰，也没有观察到其他非特异性PCR扩增产物。质粒DNA浓度在Nanodrop ^@ ND-1000 UV-Vis上测定分光光度计（NanoDrop Technologies，USA）。并从提取的质粒DNA的浓度直接计算阿霉素细菌16S rRNA基因拷贝数。将已知拷贝数的质粒DNA的6倍系列稀释液一式三份进行q-PCR测定，以产生外部标准曲线。

3. 结果与讨论

3.1. 启动期

首先，在氨氧化反应器启动的开始，有机氮转化为氨可能会由于被调节的细胞分裂而出现。因此，铵浓度甚至比流动的高得多。如图1所示。 两个反应器中的活性铵峰值达到58 mg / L。 Bi等人命名为这个时期为细胞裂解阶段（有效的氨浓度gt;1）[19]。同时，由于异养反硝化菌生长快于自养厌氧菌，反硝化菌在第一阶段可能占主导地位，导致在该阶段除去大量亚硝酸盐。如表1所示，R1的细胞裂解阶段持续20天。然而，仅在第16天，加入RGO的R2的铵浓度降低低于流动，并且几乎完全微生物裂解。此外，随着有机物质的持续消耗，由于反硝化细菌活性降低，两反应堆的亚硝酸盐去除率呈下降趋势。

图 2.在启动期间每个反应堆的流入时间过程和有效N浓度。 R1，控制反应器; R2，反应器加入100mg / L RGO。 A，NH 4 -N; B，NO 2 -N; C，NO 3 -N。

其次，检测到铵态氮浓度的一些波动，但是平均值低于氮浓度。Bi等人报道此阶段类似于滞后期[19]。 厌氧氨氧化活性的发生是同时去除氨和亚硝酸盐，如图1所示。 对于R1（对照）和R2（对照），这一阶段分别持续17天（第20-36天）和第10天（第16-25天）。在第35天，两个反应器的平均铵去除速率 在该阶段计算分别为14.7和82.8gN /（m³ d）。 R1和R2的有效硝酸盐浓度达到5.99和9.38 mg / L，在两个反应器中都显示初期厌氧活性（图2C）。

最后，铵和亚硝酸盐的去除速率的快速增加和硝酸盐积累量成比例。以R2举例，从第26天到49天，铵去除速率从33.5升至165g-N /（m³ d），而亚硝酸盐去除速率从62.4升至223g-N /（m³ d）。培养49天后，R2的铵和亚硝酸盐浓度稳定低于10mg / L。从第49天到70天，硝酸盐的产量达到8.99-13.6 mg / L，硝酸盐产量与铵消耗的化学计量摩尔比计算为0.22-0.28。这些数据体现了Bi等人研究处于进步阶段 [19]。该比率和除氮性能表明，添加RGO的R2中的厌氧氧化方法成功启动。然而，相同的现象出现在R1，直到18天后。在第67天，可以完成没有添加RGO的厌氧反应器的启动过程。 R1和R2的活动升高阶段持续24（第37-67天）和31天（第26-49天）。显然，RGO添加剂加速了厌氧反应器从常规活性污泥的启动。厌氧氨氧化工艺的启动期可以通过RGO添加从67天缩短到49天，与对照相比减少了26.9％。

3.2. 运行的稳定性

然后两台反应堆顺利运行，以便在厌氧氨氧化反应堆成功启动后，在相同的氮负荷率（NLR）情况下研究运行稳定性。这项研究分为两个阶段，包括在增加氮浓度和HRT缩短，如图3所示 。从第70天到第165天，流动的氨和亚硝酸盐浓度从50逐步增加到100 mg / L，并且HRT保持在6小时，对应于两个反应堆的总NLR在460至920 gN /（m3 d）之间 。在第165天，用RGO添加的R2的氮去除率（NRR）计算为715g-N /（m³d），而R1的NRR仅为576g-N /（m³ d）。之后，HRT从6小时缩短到3.7小时，两个反应器的NLR从165天提高到229天。在其它65天培养后，将两个反应器的NLR增加至1.52times;10 3 g-N /（m ³ d）。两个反应器的NRR分别达到846和1.08times;10³ g-N /（m³ d）。旭两个反应器的NRR比较得出，添加RGO的R2比对照高27.4％。此外，在NLR增加的两个阶段，R2的活性铵和亚硝酸盐浓度稳定地低于20mg / L，而在相同条件下，R1中的铵和亚硝酸盐浓度为约40和50mg / L。这种现象可归因于相对较高的厌氧细菌活性和对于高NLR影响的更强的稳定性，这与RGO添加密切相关。实际上，我们的初步实验结果[12]表明，厌氧氧活性可以通过添加RGO增加。新开发的厌氧反应器的运行稳定性调查与我们以前的研究一致。

图。 3.稳定运行期间每个反应堆的N和N浓度。 R1，控制反应器; R2，反应器加入100mg / L RGO。 A，NH 4 -N; B，NO 2 -N; C，NO 3 -N; D，NLR和NRR。 氮浓度增加：第70-165天; HRT缩短：第166-223天。

图. 4.整个潜伏期HDH活性变化的比较。 R1，控制反应器; R2，反应器加入100mg / L RGO。

3.3. 关键酶活性的变化

图4描绘了两个厌氧氧化反应器在操作期间的HDH活性的变化。在将活性污泥加入厌氧反应器之前，种子污泥的HDH活性仅确定为0.11lM细胞色素c /（mg蛋白质·

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